利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸技术方案

本发明专利技术提供了利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸的方法。具体地，本发明专利技术提供了一种质粒系统，所述质粒系统包括第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒，所述第一表达盒用于表达目的蛋白，所述第二表达盒用于表达氨酰基‑tRNA合成酶；第三表达盒用于编码人工tRNA。结果表明本发明专利技术的质粒系统能够将非天然氨基酸直接引入到蛋白中，成本低，产率高，环境污染小。此外，相比野生型赖氨酰‑tRNA合成酶，本发明专利技术突变型赖氨酰‑tRNA合成酶可提高非天然氨基酸插入量和含有非天然氨基酸的目的蛋白量。

【技术实现步骤摘要】
利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸
本专利技术属于生物医药工程
具体地，本专利技术涉及利用质粒系统在蛋白中引入非天然氨基酸。
技术介绍
作为蛋白质的翻译后修饰的重要位点以及多种酶活性中心的关键残基，非天然氨基酸在多种蛋白质行使其生理病理功能的过程中扮演重要的角色。对于蛋白质，特别是多肽药物，非天然氨基酸的修饰，不仅可能增强多肽药物的药效，降低药物毒性，还由于非天然氨基酸的掺入，使得多肽药物大大降低免疫原性，减少免疫排异反应，而且某些蛋白酶可能不再识别掺入非天然氨基酸的多肽物，使得药物在体内维系更长时间不被降解，从而延长药物半衰期，以革除多肽类药物不断注射给药的弊端；并且还有望通过修饰，使多肽药物“搭载”其它化学附件，从而导致疾病治疗新方法的出现。对于多肽药物的修饰，大多只通过化学合成的方法修饰。因此，本领域急需开发一种能够高效地在多肽药物中定点引入非天然氨基酸的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效地在多肽药物中定点引入非天然氨基酸的方法。本专利技术的第一方面，提供了一种质粒系统，所述质粒系统包含：(1)第一表达盒，所述第一表达盒含有编码目的蛋白的第一编码序列，所述第一编码序列中含有用于引入预定的修饰氨基酸的天然密码子，所述天然密码子为UAG(琥珀)、UAA(赭石)、或UGA(蛋白石)；和(2)第二表达盒，所述第二表达盒含有编码氨酰基-tRNA合成酶的第二编码序列；并且，所述系统还含有第三表达盒，所述第三表达盒含有编码人工tRNA的第三编码序列，其中所述人工tRNA含有对应于所述天然密码子的反密码子；并且所述的氨酰基-tRNA合成酶特异性催化所述人工tRNA形成“人工tRNA-Xa”复合物，其中Xa为氨酰基形式的所述预定的修饰氨基酸。在另一优选例中，所述质粒系统为单质粒系统或多质粒系统，优选为单质粒系统。在另一优选例中，所述天然密码子为UAG(琥珀)或UGA(蛋白石)。在另一优选例中，所述的密码子包括mRNA或DNA上对应于氨基酸的三碱基核苷酸序列。在另一优选例中，所述预定的修饰氨基酸为带有修饰基团的赖氨酸。在另一优选例中，所述修饰氨基酸选自下组：炔基氧羰基赖氨酸衍生物、叔丁氧羰基(BOC)-赖氨酸衍生物、脂肪酰化赖氨酸衍生物、或其组合。在另一优选例中，所述炔基氧羰基赖氨酸的结构如下式I所示：其中，n为0-8。在另一优选例中，所述氨酰基-tRNA合成酶为野生型的氨酰基-tRNA合成酶或突变型氨酰基-tRNA合成酶。在另一优选例中，所述氨酰基-tRNA合成酶为赖氨酰-tRNA合成酶。在另一优选例中，所述氨酰基-tRNA合成酶为突变型赖氨酰-tRNA合成酶。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶在对应于野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列中第19位精氨酸(R)和/或第29位组氨酸(H)发生突变。在另一优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶来自产甲烷古细菌的马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)或噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)。在另一优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。在另一优选例中，所述第19位精氨酸(R)突变为组氨酸(H)或赖氨酸(K)；和/或第29位组氨酸(H)突变为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶中的突变选自下组：R19H、R19K、H29R、H29K、或其组合。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶还包括选自下组的位点发生突变：第26位异亮氨酸(I)、第122位苏氨酸(T)、第309位亮氨酸(L)、第348位半胱氨酸(C)、第384位酪氨酸(Y)、或其组合。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第26位异亮氨酸(I)；优选地，所述第26位异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第122位苏氨酸(T)；优选地，所述第122位苏氨酸(T)突变为色氨酸(S)。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第309位亮氨酸(L)；优选地，所述第309位亮氨酸(L)突变为丙氨酸(A)。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第348位半胱氨酸(C)；优选地，所述第348位半胱氨酸(C)突变为色氨酸(S)。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的突变位点还包括第384位酪氨酸(Y)；优选地，所述第384位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶还包括选自下组的突变：I26V、T122S、L309A、C348S、Y384F、或其组合。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变：R19H和H29R。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变：R19K和H29R。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变：R19H和H29K。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变：R19K和H29K。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变：R19H、I26V和H29R。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变：R19H、H29R、T122S和Y384F。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶包括选自下组的突变：R19H、H29R、L309A和C348S。在另一优选例中，所述的突变型赖氨酰-tRNA合成酶除所述突变(如第19和/或29位，以及任选的第26、122、309、348和/或384位)外，其余氨基酸与SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:2所示的序列相同或基本相同。在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有赖氨酰-tRNA合成酶的活性。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列与SEQIDNO.1或SEQIDNO.:2相比具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。在另一优选例中，所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶为SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:2所示的野生型赖氨酰-tRNA合成酶经突变形成的。在另一优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种质粒系统，其特征在于，所述质粒系统含有：/n(1)第一表达盒，所述第一表达盒含有编码目的蛋白的第一编码序列，所述第一编码序列中含有用于引入预定的修饰氨基酸的天然密码子，所述天然密码子为UAG(琥珀)、UAA(赭石)、或UGA(蛋白石)；和/n(2)第二表达盒，所述第二表达盒含有编码氨酰基-tRNA合成酶的第二编码序列；/n(3)第三表达盒，所述第三表达盒含有编码人工tRNA的第三编码序列，其中所述人工tRNA含有对应于所述天然密码子的反密码子；/n并且所述的氨酰基-tRNA合成酶特异性催化所述人工tRNA形成“人工tRNA-Xa”复合物，其中Xa为氨酰基形式的所述预定的修饰氨基酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种质粒系统，其特征在于，所述质粒系统含有：
(1)第一表达盒，所述第一表达盒含有编码目的蛋白的第一编码序列，所述第一编码序列中含有用于引入预定的修饰氨基酸的天然密码子，所述天然密码子为UAG(琥珀)、UAA(赭石)、或UGA(蛋白石)；和
(2)第二表达盒，所述第二表达盒含有编码氨酰基-tRNA合成酶的第二编码序列；
(3)第三表达盒，所述第三表达盒含有编码人工tRNA的第三编码序列，其中所述人工tRNA含有对应于所述天然密码子的反密码子；
并且所述的氨酰基-tRNA合成酶特异性催化所述人工tRNA形成“人工tRNA-Xa”复合物，其中Xa为氨酰基形式的所述预定的修饰氨基酸。


2.如权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述修饰氨基酸选自下组：炔基氧羰基赖氨酸衍生物、叔丁氧羰基(BOC)-赖氨酸衍生物、脂肪酰化赖氨酸衍生物、或其组合。


3.如权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统为单质粒系统。


4.如权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述氨酰基-tRNA合成酶为赖氨酰-tRNA合成酶，较佳地为突变型赖氨酰-tRNA合成酶，更佳地所述突变型赖氨酰-tRNA合成酶在对应于野生型赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列中第19位精氨酸(R)和/或第29位组氨酸(H)发生突变。


5.如权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述目的蛋白选自下组：胰岛素、人胰岛素前体蛋白、赖脯胰岛素的前体蛋白、甘精胰岛素的前体蛋白、甲状旁腺素、可的瑞琳、降血钙素、...

【专利技术属性】
技术研发人员：查若鹏，陈卫，吴松，张振山，刘慧玲，
申请(专利权)人：苏州鲲鹏生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32