一种重组人胰岛素的制备和纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种重组人胰岛素的制备和纯化方法。具体地，本发明专利技术提供了制备人胰岛素产品的方法，包括胰蛋白酶和羧肽酶B酶切，盐酸脱保护等步骤。本发明专利技术的方法不需要无机盐洗脱，不需使用大量的有机试剂，生产工艺简单，环境污染小，生产成本低，适宜推广。适宜推广。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人胰岛素的制备和纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地涉及一种重组人胰岛素的制备和纯化方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急慢性并发症，尤其是慢性并发症累计多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
[0003]所有I型糖尿病患者都须接受胰岛素治疗，大多数II型糖尿病患者随着病程进展，最终也须使用胰岛素控制血糖。现有证据表明，糖尿病患者一旦具有开始胰岛素治疗的指征，就应尽早启动胰岛素治疗，这样可以使血糖得到更持续、稳定、良好的控制，在很大程度上减少并发症的发生。
[0004]人胰岛素是一种由51个氨基酸组成的蛋白质类激素，由胰脏内的胰岛细胞分泌。胰岛素参与人体内的糖代谢，从而控制人体内的血糖平衡。1978年，美国的Genetech公司首次利用生物重组的方法在大肠杆菌内表达胰岛素。在“胰岛素原”的酶切复性过程中，胰蛋白酶识别胰岛素B29位的赖氨酸，产生大量的B30位苏氨酸消去的胰岛素副产物(DesB30-胰岛素)。由于DesB30-胰岛素和胰岛素之间只相差一个苏氨酸，他们之间的分离非常的困难。现有技术中有关于胰岛素的复性方法，例如在中国专利CN1132845C中公开了获得具有正确键合的胱氨酸键的胰岛素前体的改进的方法，即在半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐和离液助剂存在下，获得到30％～50％的正确复性产物。中国专利CN103172727A中公开了一种高效体积排阻色谱复性同时纯化重组人胰岛素原的方法，尝试该方法在BOC胰岛素原进行复性中，结果显示回收率低。
[0005]现有的重组人胰岛素中间体基本都是采用离子交换与反相层析纯化方式。伊莱利利公司(中国专利CN95196266.3)公开了一种采用C4反相高效色谱柱的纯化方式；康久化学生物技术公司(中国专利，CN200480021270.5)公开了一种采用phenomenex luna phenyl-hexyl反相色谱柱的纯化方式；从已有的文献资料可以看到通过反相高效液相色谱的纯化能够得到产品，但是这种纯化方式对于设备的要求较高，需要整套能够耐受高压的色谱系统，而且制备过程中会使用大量的乙腈等有机试剂，成本较高而且不环保；样品在反相制备柱上的吸附较强，导致回收率不高，且容易对反相制备柱造成不可逆的损坏。
[0006]BOC胰岛素的BOC基团修饰能够改变胰岛素前体的疏水区域，促进胰岛素前体的正确折叠。在酶解过程中，B29位BOC赖氨酸不会被酶解掉，不会产生B30位苏氨酸消去的胰岛素副产物。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种重组人胰岛素的制备和纯化方法。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种制备人胰岛素产品的方法，所述方法包括步骤：
[0009](i)提供一重组人胰岛素原(第一蛋白)溶液；
[0010](ii)利用胰蛋白酶和羧肽酶B对所述重组人胰岛素原(第一蛋白)进行酶切，从而获得经酶切的重组人BOC-胰岛素(第二蛋白)，其中，所述重组人胰岛素原与胰蛋白酶的质量比为1:3000-8000，较佳地为1:5000-6000，且所述重组人胰岛素原与羧肽酶B的质量比为1:5000-15000，较佳地为1:8000-12000；
[0011](iiii)任选地，对所述经酶切的重组人BOC-胰岛素(第二蛋白)进行纯化，获得初步纯化的重组人胰岛素(第三蛋白)；
[0012](iv)向上一步骤获得的重组人BOC-胰岛素(第二蛋白或第三蛋白)中加入盐酸，进行脱保护反应，从而获得脱保护的重组人胰岛素(第四蛋白)，其中，所述盐酸的浓度为2-4M，较佳地为2.5-3.5M，更佳地为2.8-3.2M；并且，所述盐酸与BOC-胰岛素溶液的体积比为(5-10)：100，较佳地(6-8)：100；
[0013](v)任选地，对所述的脱保护的重组人胰岛素(第四蛋白)进行纯化，从而制备获得所述人胰岛素产品。
[0014]在另一优选例中，所述的人胰岛素产品中包含的人胰岛素纯度高于99.5％。
[0015]在另一优选例中，所述的人胰岛素产品中包含的人胰岛素具有天然胰岛素活性。
[0016]在另一优选例中，重组人BOC-胰岛素是在B29(胰岛素B链29位)为保护赖氨酸的胰岛素。
[0017]在另一优选例中，所述的保护赖氨酸为带有保护基团的赖氨酸。
[0018]在另一优选例中，所述的保护赖氨酸为Nε-(叔丁氧碳基)-赖氨酸。
[0019]在另一优选例中，重组人BOC-胰岛素为融合蛋白。
[0020]在另一优选例中，在步骤(ii)中，在胰蛋白酶和羧肽酶B酶切时，所述重组人胰岛素原的B链30位氨基酸不会被水解。
[0021]在另一优选例中，在步骤(i)中，利用重组人BOC-胰岛素生产菌株进行发酵，并分离获得重组人BOC-胰岛素蛋白。
[0022]在另一优选例中，在步骤(i)中，分离获得的重组人BOC-胰岛素蛋白为包涵体。
[0023]在另一优选例中，在步骤(i)中，还包括对所述包涵体进行变性和复性，从而获得蛋白折叠正确的重组人BOC胰岛素的步骤。
[0024]在本专利技术的第二方面，提供了一种对重组人BOC-胰岛素进行酶切的方法，所述方法包括步骤：
[0025](I)提供重组人胰岛素原溶液；和
[0026](II)向所述的重组人胰岛素原溶液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，进行酶切反应，从而获得重组人BOC-胰岛素溶液；
[0027]其中，所述重组人胰岛素原与胰蛋白酶的质量比为1:3000-8000，较佳地为1:5000-6000，且所述重组人胰岛素原与羧肽酶B的质量比为1:5000-15000，较佳地为1:8000-12000。
[0028]在另一优选例中，所述的胰蛋白酶为重组的人胰蛋白酶。
[0029]在另一优选例中，所述的羧肽酶B为重组的人羧肽酶B。
[0030]在另一优选例中，所述的重组人胰岛素原包含胰岛素A链、B链和C链。
[0031]在另一优选例中，所述的重组人胰岛素原的B链29位为保护赖氨酸。
[0032]在另一优选例中，所述的重组人胰岛素原经生产菌株发酵获得。
[0033]在另一优选例中，所述的生产菌株发酵获得的人胰岛素原为包涵体形式，对其进行变性和复性后获得蛋白折叠正确的重组人胰岛素原。
[0034]在另一优选例中，在步骤(II)中，所述酶切的温度为15-25℃，较佳地为18-22℃。
[0035]在另一优选例中，在步骤(II)中，所述酶切的时间为10-25h，较佳地为14-20h。
[0036]在另一优选例中，在步骤(II)中，所述的重组人胰岛素原溶液的pH为8.0-9.2。
[0037]在本专利技术的第三方面，提供了一种对BOC-胰岛素进行脱保护的方法，其特征在于，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备人胰岛素产品的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(i)提供一重组人胰岛素原(第一蛋白)溶液；(ii)利用胰蛋白酶和羧肽酶B对所述重组人胰岛素原(第一蛋白)进行酶切，从而获得经酶切的重组人BOC-胰岛素(第二蛋白)，其中，所述重组人胰岛素原与胰蛋白酶的质量比为1:3000-8000，较佳地为1:5000-6000，且所述重组人胰岛素原与羧肽酶B的质量比为1:5000-15000，较佳地为1:8000-12000；(iiii)任选地，对所述经酶切的重组人BOC-胰岛素(第二蛋白)进行纯化，获得初步纯化的重组人胰岛素(第三蛋白)；(iv)向上一步骤获得的重组人BOC-胰岛素(第二蛋白或第三蛋白)中加入盐酸，进行脱保护反应，从而获得脱保护的重组人胰岛素(第四蛋白)，其中，所述盐酸的浓度为2-4M，较佳地为2.5-3.5M，更佳地为2.8-3.2M；并且，所述盐酸与BOC-胰岛素溶液的体积比为(5-10)：100，较佳地(6-8)：100；(v)任选地，对所述的脱保护的重组人胰岛素(第四蛋白)进行纯化，从而制备获得所述人胰岛素产品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组人BOC-胰岛素是在B29(胰岛素B链29位)为保护赖氨酸的胰岛素。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的保护赖氨酸为Nε-(叔丁氧碳基)-赖氨酸。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中，在胰蛋白酶和羧肽酶B酶切时，所述重组人胰岛素原的B链30位氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：查若鹏，唐亚连，吴松，张振山，钱俊晖，李克朗，梁新光，杨接运，
申请(专利权)人：苏州鲲鹏生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：