一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法技术

本发明专利技术提供一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，包括以下步骤：S1、质粒提取得到重组质粒Aga0917‑pMD19

【技术实现步骤摘要】
一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法。
技术介绍
琼胶寡糖(AOS)具有很多特殊的生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、消炎、美白、保湿等功效，在预防糖尿病、诱导细胞凋亡等方面具有显著的生理活性，因此，在医药、食品、化妆品等行业极具潜在的应用价值。传统的琼胶寡糖制备方法包括物理法和化学法，其中物理法主要是利用超声、微波和辐射降解，化学法主要是利用酸、碱降解。这些方法虽然效率较高，但是均存在降解条件不易控制、产物均一性差等缺点，而且还存在着物理降解能耗高、化学降解环境污染严重等问题，成为制约琼胶寡糖高效制备的主要瓶颈。随着琼胶酶研究的兴起和蓬勃发展，酶法制备琼胶寡糖已经成为新的研究趋势，利用琼胶酶水解琼胶生产琼胶寡糖的技术被认为是当今最理想的绿色环保生产技术。琼胶酶是琼胶酶解过程中的重要酶类，是一类能够降解琼脂糖的糖苷水解酶。琼脂糖是由(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖残基与(1-4)-O-3，6-内醚-α-L-吡喃半乳糖残基交替连接组成的线性链状分子。经琼胶酶作用后可产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、质粒提取：/n将菌株Aga0917-pMD19

【技术特征摘要】
1.一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、质粒提取：
将菌株Aga0917-pMD19T-Top10和CBM13-pUC57-DH5α接种到5ml的LB液体培养基中，并向LB液体培养基中加入Amp溶液，培养12～14小时，按试剂盒说明书方法提取重组质粒Aga0917-pMD19T和CBM13-pUC57-DH5α；
S2、PCR扩增：
以步骤S1得到的重组质粒Aga0917-pMD19T为模板，F0917和Rm为引物，进行PCR扩增反应得到Aga0917基因片段，PCR扩增反应体系：PrimeSTARMax(2x)为25μL、F0917为2μL、Rm为2μL、重组质粒Aga0917-pMD19T为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
以步骤S1得到的重组质粒CBM13-pUC57为模板，Fm和FusionR为引物，进行PCR扩增反应得到CBM13基因片段，PCR扩增反应体系：PrimeSTARMax(2x)为25μL、FusionR为2μL、Fm为2μL、重组质粒CBM13-pUC57-DH5α为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
S3、重叠PCR：
将步骤S2得到的两个扩增产物进行重叠PCR，反应体系为：PrimeSTARMax(2x)为12.5μL、Aga0917基因片段为2μL、CBM13基因片段为2μL、DW为8.5μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、10个循环，然后加入引物F0917和FusionR各1μL，再按照95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、25个循环得到Aga0917-CBM13；
S4、末端加A
向步骤S3得到的Aga0917-CBM13中加入Taq聚合酶进行PCR反应对Aga0917-CBM13末端加A，反应结束后，根据凝胶回收试剂盒的说明回收末端带A的目的片段Aga0917-CBM13；
S5、克隆载体构建：
将步骤S4得到的末端带A的目的片段Aga0917-CBM13与克隆载体pMD19T进行连接，得到Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液，且连接体系：Aga0917-CBM13为4μL、pMD19T为1μL、SolutionI为5μL；
S6、表达载体构建：
A、将Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株的质粒Aga0917-CBM13-pMD19T，得到Aga0917-Cbm13-pMD19T质粒溶液，将得到的Aga0917-CBM13-pMD19T质粒溶液与BamHI酶、XholI酶和10×BufferK溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到Aga0917-CBM13基因片段；
B、将pET28a-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取pET28a-TOP10菌株的质粒pET28a，得到pET28a质粒溶液，将得到的pET28a质粒溶液与BamHI酶、XholI酶和10×BufferK溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到线性表达载体pET28a；
C、将步骤A得到的Aga0917-CBM13基因片段、步骤B得到的线性表达载体pET28a、以及SolutionI溶液按照体积比为1∶4∶5在冰上向EP管内混合均匀，再置于16℃恒温水浴锅内过夜连接，得到连接体系；
D、从-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细胞在冰上融化10min，在超净工作台内取出100μLTOP10感受态细胞并在超净工作台内向感受态细胞加入1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，崔彩霞，张玉阳，周晨妍，刘婷威，张瑶，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41