一种带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊多重PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种多重PCR同时检测带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊的试剂盒。该试剂盒包括带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊的特异性引物、10×buffer、dNTPs、MgCl

【技术实现步骤摘要】
一种带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊多重PCR检测试剂盒
本专利技术涉及一种多重PCR同时检测带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊的试剂盒。
技术介绍
按蚊(Anopheles)属昆虫纲双翅目蚊科按蚊属，已知约450种及亚种，分为6个亚属，呈世界性分布，主要分布在热带地区。按蚊雌虫吸取人、畜的血，可传播疟原虫、丝虫病等疾病，根据世界卫生组织的报告，2016年全球发生2.16亿例疟疾，44.5万人死于疟疾，受到淋巴丝虫病威胁的人数高达8.93亿，约4000万人被疾病毁容和丧失劳动力。随着自然条件的变化和国际交通、贸易、旅游业的发展，蚊虫及其携带的病原体可借助交通工具、集装箱、货物、邮件等在国际间传播，使原本局限在一定范围内的虫媒传染病突破国境或自然地理的界限，在全球范围内广泛传播与流行，对输入国的卫生安全造成极大的威胁。因此，蚊类及其传播疾病的监测，对保障口岸地区的卫生安全，预防和控制虫媒传染病传入、传出具有重要意义。现阶段对按蚊的鉴定，主要依靠形态学鉴定，其结果准确性难以保证，且对于残缺样本和非成虫期的样本，形态学无法鉴定；分子标记的方法耗时长成本高，对人员和设备的要求也较高。多重PCR技术是在一个反应体系中同时扩增多个目标序列，具有用时短、操作简单、准确性高和特异性强的优点。因此，迫切需要建立一种能快速准确鉴定带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊的多重PCR检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种用于鉴定带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊多重PCR检测试剂盒及制备方法，具有较高的特异性和敏感性，可在较短时间内测出结果，无需测序，大大节约成本。本专利技术提供了带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊的特异性引物序列，具体如下：1)带足按蚊：扩增目的片段55bpF3：5’-AGCATGAGCAATTCCAGAT-3’(SEQIDNO.5)R3：5’-GGCAGGAACAGGATGAAC-3’(SEQIDNO.6)2)雷氏按蚊：扩增目的片段132bpF8：5’-GTAATCCCTGGAGATCGTATA-3’(SEQIDNO.15)R8：5’-ATCTGGAATTGCTCATGCT-3’(SEQIDNO.16)3)须喙按蚊：扩增目的片段250bpF17：5’-GCTCCTGCTAATACTGGTAA-3’(SEQIDNO.33)R17：5’-CTGGAACTGGATGAACTGT-3’(SEQIDNO.34)本专利技术还提供了一种用于鉴定带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述3对引物、10×buffer、dNTPs、MgCl2、Taq酶、模板DNA、无菌双蒸水。该试剂盒的使用步骤如下：1)配置PCR反应液：50μL所述反应液包含5μL10×buffer、3μLdNTPs，3μLMgCl2，1μLTaq酶，6条引物各1μL(浓度为50pmol/μL)，2μL模板DNA，无菌双蒸水补足体积至50μL。2)多重PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，进行35个循环；最后72℃终延伸10min。3)PCR扩增产物的鉴定：取PCR扩增产物10μL，置于QIAxcelAdvanced毛细管电泳仪中进行电泳，选定AlignmentMarker为15bp/600bp，SizeMarker为25bp-500bp(25bp、50bp、75bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、400bp、500bp)，电泳后可见多重PCR检测带足按蚊出现55bp的特异性条带，雷氏按蚊出现132bp特异性条带，须喙按蚊出现250bp特异性条带，且无其它杂带。特异性试验：采用该试剂盒对多种样本进行检测，结果如图1，电泳后可见多重PCR检测带足按蚊出现55bp的特异性条带，雷氏按蚊出现132bp特异性条带，须喙按蚊出现250bp特异性条带，且无其它杂带；美彩按蚊、多斑按蚊、乌头按蚊、克劳按蚊、迷糊按蚊、棋斑按蚊及无菌双蒸水结果均为阴性，这表明该方法具有良好的特异性。多重PCR敏感性试验：用紫外分光光度计对蚊虫DNA进行定量，调整浓度为10ng/μL，再按10倍梯度稀释至10-6ng/μL，共计8个浓度，确定其检测下限为10-4ng/μL，这表明该方法具有良好的敏感性(图2)。本专利技术对样本适用范围广，适合日常蚊媒监测中各种方式捕获的蚊种，对标本的完整性没有要求，同时可对非成虫阶段样本进行鉴定。试剂盒提供的试剂，无感染性，无生物安全隐患成分，使用安全性很高。本专利技术的多重PCR检测试剂盒，可在收到DNA样品后的3小时内给出定性检测结果，节约成本和时间，对人员设备要求低，是一种检测带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊的有效工具。本专利技术和已有技术相比，其优势是明显的，本专利技术可在同一反应体系内同时检测是否被测样本是否为带足按蚊、雷氏按蚊或须喙按蚊，具有较高的特异性和敏感性，可在短时间内测出结果，无需测序，高效便捷的同时能够节约成本。附图说明图1是多重PCR特异性检测试验结果，M为DNAMarker，1-2为带足按蚊多重PCR产物，3-4为雷氏按蚊多重PCR产物，5-6为须喙按蚊多重PCR产物，7-8为美彩按蚊多重PCR产物，9-10为多斑按蚊多重PCR产物，11-12为乌头按蚊多重PCR产物，13-14为克劳按蚊多重PCR产物，15-16为迷糊按蚊多重PCR产物，17-18为棋斑按蚊多重PCR产物，19-20为无菌双蒸水。图2是多重PCR敏感性试验结果，M为DNAMarker，1-8为浓度为10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、10-6ng/μL的带足按蚊多重PCR检测结果；9-16为浓度为10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、10-6ng/μL的雷氏按蚊多重PCR检测结果；17-24为浓度为10ng/μL、1ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL、10-5ng/μL、10-6ng/μL的须喙按蚊多重PCR检测结果。图3是带足按蚊引物筛选试验结果，M为DNAMarker，1、3、5、7、9、11分别为第1-6组引物的PCR检测结果，模板为1ng/μL带足按蚊模板DNA，2、4、6、8、10、12分别为第1-6组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水。结果显示5所在的第3组引物PCR产生的条带清晰，约55bp，无其余杂带。图4是雷氏按蚊引物筛选试验结果，M为DNAMarker，1、3、5、7、9、11分别为第7-12组引物的PCR检测结果，模板为1ng/μL雷氏按蚊模板DNA，2、4、6、8、10、12分别为第7-12组引物的阴性对照，模板为无菌双蒸水。结果显示3所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊多重PCR检测试剂盒，包括3对特异性引物、10×buffer、dNTPs、MgCl

【技术特征摘要】
1.一种带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊多重PCR检测试剂盒，包括3对特异性引物、10×buffer、dNTPs、MgCl2、Taq酶、模板DNA、无菌双蒸水，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨庆贵，陶莉，何江，周维，田玲玲，孙立新，何德雨，苏小建，朱国强，胡学锋，贺骥，谭伟龙，
申请(专利权)人：江苏省检验检疫科学技术研究院，南京中医药大学，江苏国际旅行卫生保健中心南京海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：江苏;32