一种同时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法技术

本发明专利技术属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可同时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法。本发明专利技术方法对待测样品经预处理后，利用霉酚酸酯和霉酚酸在碱性条件下有强的荧光吸收的特征，在分析色谱柱分离后衍生化，然后用荧光检测器检测。该法可使霉酚酸酯和霉酚酸的灵敏度大为提高。本法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合于临床常规监测和药动学研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种同 时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法。
技术介绍
霉酚酸酯(MycophenolateMofetil,MMF，RS61443;商品名Cellcept,骁悉) 是一种新型的抗代谢类免疫抑制剂，临床上广泛用于器官移植后的抗排异治疗。 该药物是霉酚酸(Mycophenolic Acid， MPA)的2-乙基酯前体药物，可显著提高 MPA的体内生物利用度。MMF 口服后，在体内迅速被水解脱酯转化为活性代谢 产物MPA，后者继而与葡萄糖醛酸结合，转化为没有活性的代谢产物葡糖苷酸化 物(Mycophenolic acid glucuronide, MPAG),其主要代谢途径如图1所示。MPAG 在体内的浓度大大高于MPA，且能通过肠肝循环再次水解为MPA，重新进入体 内发挥作用，因此MPAG能够影响MPA的体内药动学。同时已有多个研究表明， MMF在部分病人中的生物利用度低于80。/。，甚至低于50%，不完全的生物转化 同样可能影响MPA的药动学。此外，由于MMF, MPA和MPAG在体内均由尿 液排泄，所以，通过同时测定尿液中三种物质的浓度，并据此调整给药剂量，对 保证用药的安全和疗效有重要意义。迄今为止，尚未见国内、外有关同时测定人尿液中MMF、 MPA和MPAG 的浓度的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便、快速、灵敏、可同时测定尿液中霉酚酸酯 (Mycophenolate Mofetil， MMF )、霉酚酸(Mycophenolic Acid， MPA)和葡糖苷酸 化物(Mycophenolic acid glucuronide, MPAG)浓度的方法。本方法无需昂贵的设 备和试剂，具有操作简便、快速、尿液用量少、成本低等优点，适合临床常规监 测和药动学研究。本方法的技术方案是待测样品预处理后，先用紫外检测器检测MPAG，然 后利用MMF和MPA在碱性条件下有强的荧光吸收的特征，在分析色谱柱分离后在线衍生化(碱化)，用荧光检测器检测。该方法能使MMF和MPA的检出灵敏 度明显提高。本专利技术方法包括以下步骤1) 样品预处理取待测样品，加入甲醇、去离子水或两者混合液，进行尿样稀 释，离心后取上清液进样；2) 样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基或辛烷基键合相硅 胶，高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用 等度洗脱；分别采用紫外和荧光检测器分别检测MPAQ MMF和MPA的峰面 积，用标准曲线方程换算成三者的浓度；3) 样品柱后衍生化采用附加一个高压泵和一个三通连接柱后衍生化试剂，并 用串联方式连接紫外检测器和荧光检测器，使分离后的样品有荧光信号。本方法尿液MMF、 MPA和MPAG测定的线性范围分别为0.075 1.000 Hg/ml， 0.1 10.0 ng/ml和20 400 ng/ml。测定偏差均在士 15 %以内，日内和日 间的精密度(相对标准差，RSD)均小于13%。本方法采用附加一个高压泵和一个三通连接柱后衍生化试剂，并用串联方式 连接紫外检测器和荧光检测器，进行样品柱后在线衍生化，能使分离后的样品有 荧光信号。本方法用于同时定量测定尿液中MMF、 MPA和MPAG浓度，首先定量分 取尿液样品，加入定量的尿液稀释剂，混匀、离心，取上清液进样，经紫外检测 器检测MPAG再用NaOH或KOH溶液进行衍生化后用荧光检测器检测MMF 和MPA。上述测定方法中，加入的尿液稀释剂为甲醇、去离子水或二者混合物。上述测定方法中，分别用紫外检测器和荧光检测器测定MPAG MMF和MPA 的峰面积，用标准曲线方程换算成MPAQMMF和MPA的浓度。上述方法中， 采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基或辛垸基键合相硅胶为填料的液相 色谱柱。高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用等度 洗脱。其中色谱条件是，HPLC系统日本岛津公司LC-10A高效液相仪(系统包括 双泵，紫外检测器和荧光检测器)；色谱柱C8分析柱；流动相釆用等度洗脱，甲醇一0.1。/oTFA (50:50-60:40，V/V);流速1.0-1.2 ml/min;柱温40-45 °C;荧光 激发波长342 - 344 nm，发射波长425 - 427 nm。本专利技术方法能同时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物，快速准确、 操作简便、灵敏度高、成本低，适合临床常规监测和药动学研究。具有如下优点 在本方法测定条件下，人体内源性物质以及常用合并用药均不干扰测定，尿液 MMF、MPA和MPAG测定的线性范围分别为0.075 1.000 ng/ml,0.1 10.0吗/ml 和20 400 pg/ml。测定偏差均在士 15 %以内，日内和日间的精密度(相对标准 差，RSD)均小于13 %。 附图说明图1是霉酚酸酯的主要代谢途径，其中，MMF:霉酚酸酯；MPA:霉酚酸；MPAG:葡糖醛酸化霉酚酸。 图2是色谱系统装置示意图。图3:典型色谱图志愿者空白尿液色谱图(a)荧光(b)紫外；志愿者服用MMF 750mg bid、强的松和环孢素A的尿液色谱图(c)荧光，(d)紫外；其中1: MMF; 2: MPA; 3: MPAG图4:典型色谱图未服用MMF的肾移植患者空白尿液色谱图(a)荧光(b)紫外；实际肾移植患者服用MMF 750mg bid、强的松和环孢素A的尿液色谱 图(C)荧光(d)紫外； 其中1: MMF; 2: MPA; 3: MPAG 。具体实施例方式实施例1:志愿者尿样MMF, MPA和MPAG测定色谱条件HPLC系统日本岛津公司LC-10A高效液相仪(系统包括LC-10AD泵， LC-10AT泵，SPD-10A紫外检测器，RF-10AXL荧光检测器，SIL-10A自动进样 器，CBM-10A系统通讯器，柱温箱，Class-LC 10 Version 1.63色谱工作站)；色 谱柱Kromasil-C18 (150 mm x 4.6 mm， 5 nm);流动相采用等度洗脱，甲醇—0.1%TFA (45:55，V/V);流速1.2ml/min;柱温40。C;荧光激发波长342nm, 发射波长425 nm;。 尿液样品预处理精密吸取100pL尿样置1.5mL离心管中，加甲醇溶液500pL稀释，涡旋 振荡15s，离心5min (20,627 xg， 4'C)，取上清液20pL进样，外标法以峰面 积定量。专属性取不同来源的8名未服用MMF的肾移植患者的空白血浆，按照上述样品预 处理和测定方法进行测定，未发现内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常 见合并用药对乙酰氨基酚、阿昔洛韦、阿替洛尔、硫唑嘌呤、卡维地洛、环丙沙 星、氯硝西泮、氯氮平、环孢素A、地西泮、二甲双胍、多沙唑嗪、泛昔洛韦、 非诺贝特、呋塞米、更昔洛韦、格列吡嗪、氢氯噻嗪、布洛芬、吲哚美辛、厄贝 沙坦、氯沙坦、甲氧氯普胺、美托洛尔、氧氟沙星、非那西丁、泼尼松、利巴韦 林、西罗莫司、他克莫司、替米沙坦、伐昔洛韦、缬更昔洛韦和缬沙坦等对测定 也没有干扰。MMF、 MPA、 MPAG和内标的典型色谱保留时间分别为6.5、 15.7、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢物的方法，其特征是待测样品预处理后，在分析色谱柱分离后衍生化，然后用荧光检测器检测，包括以下步骤：　１）样品预处理：　取待测样品，加入甲醇、去离子水或两者混合液，进行尿样稀释，离心后取 上清液进样；　２）样品分离　采用通用型的液相色谱柱，其填料为十八烷基或辛烷基键合相硅胶，高效液相系统采用通用型的紫外和荧光检测器以及高压泵，流动相采用等度洗脱；分别采用紫外和荧光检测器分别检测霉酚酸酯、霉酚酸和葡糖苷酸化物的峰面 积，用标准曲线方程换算成三者的浓度；　３）样品柱后衍生化　采用附加一个高压泵和一个三通连接柱后衍生化试剂，并用串联方式连接紫外检测器和荧光检测器，使分离后的样品有荧光信号。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：焦正，道毅俊，施孝金，李中东，钟明康，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]