一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法技术

本发明专利技术涉及检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下:VLTTGLPALISWIK。该方法具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于复杂基质中蜂毒肽的准确定量，对保护蜂毒肽消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法
本专利技术涉及检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法。
技术介绍
蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的毒液，它是蜜蜂蜇刺敌害时释放的一种生物武器。蜂毒中含有丰富的酶、多肽、生物胺、激素、有机酸、氨基酸等物质，其中蜂毒肽(蜂毒溶血肽)是蜂毒中主要成分，它占到干蜂毒重量的50%以上。蜂毒肽是由26种氨基酸组成的小肽类物质，呈α-螺旋构象，它具有广泛且强烈的生物学活性，如抗菌、抗炎、镇痛、免疫调节、抗病毒和抗肿瘤等功效。目前，我国和全球多个国家均已批准蜂毒肽作为上市药物，用于治疗风湿性疾病和周围神经炎。近年来研究发现，蜂毒肽在皮肤保养和部分皮肤病防治方面疗效确切，它能刺激肌肤胶原蛋白产生，紧实提拉，抚平细纹，恢复弹性，从而使得蜂毒肽成为护肤品行业的新宠。目前，国内外已经有众多企业开展了蜂毒肽在护肤品中应用探索，并在市场上推出了各式各样的护肤产品，如蜂毒保湿水、蜂毒护肤霜、蜂毒面膜等。一只成年工蜂蜇刺时，分泌的蜂毒肽仅仅几十微克，足见蜂毒产量非常稀少，从而导致蜂毒肽原料价格非常昂贵。近年来，采用电击方式收获蜂毒的方法虽然有效的提高了蜂毒产量，即便是如此，蜂毒肽的价格仍然比黄金要昂贵许多。鉴于蜂毒肽的高昂的价格，护肤品中添加蜂毒肽会显著增加生产成本，从而导致标识蜂毒肽的护肤品价格显著高于普通护肤品。当前，我国并未颁布有关护肤等产品中蜂毒肽的含量测定标准，不同企业的生产方式和质控标准并不统一，产品中蜂毒肽含量的标识完全基于企业自律，从而导致市场蜂毒肽类护肤品的质量参差不齐，甚至出现了假冒伪劣的现象。因此，加快制定护肤品等产品中蜂毒肽的准确定量分析方法已经成为养蜂业和护肤行业的共识。当前，蜂毒肽的来源主要是来自规模化养殖的蜜蜂：意大利蜜蜂和中华蜜蜂，两者生产的蜂毒肽均是有26个氨基酸组成，且氨基酸序列完全一致，为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ（SEQIDNo.1）。当前常用的检测方法主要是通过液相串联质谱的技术定量测定完整蜂毒肽，检测其多电荷母离子及子离子进行定量。由于护肤品等产品中蜂毒肽的含量很低，仅处于痕量水平，而其基质又十分复杂，采用现有的分析方法，难以实现护肤品等产品中蜂毒肽的准确定量。
技术实现思路
本专利技术提供的方法有效克服了现有蜂毒肽分析方法的弊端，通过检测酶解之后的蜂毒肽的特征肽段，实现了复杂基质中蜂毒肽的准确定量。该方法可以用于护肤品、牙膏、膏药等产品中蜂毒肽的定量分析，对保护蜂毒肽消费者的权利具有一定的现实意义，同时为后续蜂毒肽行业标准的制定提供了方法参考。具体而言，本专利技术首先提供了一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下:VLTTGLPALISWIK（SEQIDNo.2），并通过Uniprot和NCBI数据库进行特异性验证。作为优选，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z756.46343([M+2H]2+)；子离子图谱中包含碎片离子m/z927.56409、m/z585.35938；其允许偏差应在10ppm以内。作为优选，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。作为优选，所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z761.47835；子离子包含m/z935.60406和m/z593.43632；其允许偏差应在10ppm以内。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特异性碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定所求的该蜂毒样本中的蜂毒肽含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂毒质量。作为优选，所述待测样本的前处理包括：对待测样本中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解，对酶解产物进行除盐后，用0.1%甲酸溶液复溶。作为优选，采用UHPLC-QExactiveplus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。优选的，液相色谱条件如下：色谱柱：C18柱；流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-1.0min，5%流动相B；1.0-2.0min，5-15%流动相B；2.0-12.0min，15-40%流动相B；12.0-14.0min，40-95%流动相B；14.0-16.5min，95%流动相B；16.0-17.5min，5%流动相B；流速：0.30mL/min；进样量：5.0µL；柱温：40℃。在一个优选的实施方式中，所述C18色谱柱为ThermoFisherHypersilGold(100mm×2.1mm,1.9μm)。优选的，质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速38arb；辅助气的流速15arb；挡锥气的流速0arb；电喷雾电压3.2kV；离子导管的温度275℃；S-lensRFlevel设为60；离子源温度380℃；采集的模式为正离子模式下的FullMS-ddMS2。应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本专利技术保护范围。基于高分辨质谱提供的精确质量数，上述方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相色谱串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。本领域人员可对上述优选方案进行组合，得到本专利技术的较佳实施例。本专利技术还提供一种用于检测蜂毒肽的试剂盒，标准物质包括序列为VLTTGLPALISWIK的特征肽段。作为优选，所述标准物质还包括所述特征肽段的内标肽段，所述内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术发现了蜂毒肽的特征肽段，并据此建立了鉴别和定量蜂毒肽的检测方法，用于辅助蜂毒掺假的鉴别，该检测方法具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，并且适用于复杂基质中蜂毒肽的检测，对于维护蜂毒行业健康发展和蜂毒消费者的权益具有重大意义。附图说明图1.A为未酶切的蜂毒样品通过UHPLC-QExactiveplus提取的蜂毒肽特征肽段的离子流图；B为酶切过的蜂毒样品通过UHPLC-QExactiveplus提取的蜂毒肽特征肽段的离子流图。图2.A为通过UHPLC-QExactiveplus检测的未酶切蜂毒中蜂毒肽特征肽段的二级碎片质谱图；B为通过UHPLC-QExactiveplus检测的酶切过的蜂毒样品蜂蜜中蜂毒肽的特征肽段的二级碎片质谱图。图3.A为未酶切的蜂毒样品通过UHPLC-QExactiveplus提取的稳定同位素内标肽段VLTTGLPALISWIK*的离子流图；B为酶切过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下:VLTTGLPALISWIK。/n

【技术特征摘要】
1.一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法，在待测样本中检测蜂毒肽的特征肽段，所述特征肽段的序列如下:VLTTGLPALISWIK。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z756.46343([M+2H]2+)；子离子图谱中包含碎片离子m/z927.56409、m/z585.35938；其允许偏差应在10ppm以内。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：VLTTGLPALISWIK*，其中，K*表示赖氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z761.47835；子离子包含m/z935.60406和m/z593.43632；其允许偏差应在10ppm以内。


5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本的前处理包括：对待测样本中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解，对酶解产物进行除盐后，用0.1%甲酸溶液复溶。


6.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其特征在于，采用UHPLC-QExactiveplus或三重四级杆质谱进...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，蔡冬梅，傅怡，周金慧，杨宇晖，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11