一种抗虫蛋白mVIP3An18、编码基因和应用制造技术

本发明专利技术提出了一种抗虫蛋白mVIP3An18、编码基因和应用。该抗虫蛋白mVIP3An18的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。所述应用是编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用，在制备重组抗虫蛋白mVIP3An18中的应用，以及抗虫蛋白mVIP3An18在制备抗虫剂中的应用。本发明专利技术通过对抗虫蛋白的人工改造及其植物表达载体的优化增加了其在转基因材料中的表达量且不影响其原本抗虫功能和转基因玉米的其他农艺性状，因此能够更容易获得抗虫效果。

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫蛋白mVIP3An18、编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程与分子生物学
，具体涉及一种抗虫蛋白mVIP3An18、编码基因和应用。
技术介绍
农药的大规模使用尽管是当前防治病虫害的主要手段，但其不仅增加了农作物的生产的人工投入，增加生产成本，还因农药残留对使用者的身体健康构成威胁。来源于苏云金芽孢杆菌的各种抗虫基因的农作物转基因防治害虫的策略给全球农业生产带来显著的经济效益，极大的削减了粮食生产中化学农药的依赖。因此，近年来转基因抗虫玉米、水稻、棉花等农作物的种植面积逐年提升，新型安全可靠的抗虫基因的挖掘和开发成为分子农业领域的研发热点。营养期杀虫蛋白(vegetativeinsecticidalproteins,Vips)是最早分离自苏云金芽胞杆菌AB88菌株的上清发酵液中的一种抗虫蛋白，因菌种从对数生长期到芽胞期均能检测到该蛋白的表达，因此得名。通过对其氨基酸序列分析发现，该蛋白家族成员与任何已知的晶体杀虫蛋白之间不存在同源性。目前该家族研究最为深入的是Vip3A蛋白，其对小地老虎(Agrotisipsilon)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)以及目前构成我国棉花和粮食作物生产最为严重威胁的草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)等各种鳞翅目昆虫具有强效且广谱的杀虫活性(Beardetal.,2008；Ramasamyetal.,2008；Yuetal.,2012)。在芽胞期表达的杀虫伴胞晶体蛋白主要是通过敏感昆虫吞食后经碱性肠液水解为具有毒素活性的核心片段(Hofte和Whiteley,1989)，在通过与昆虫肠道上皮细胞的受体蛋白结合，引起穿孔从而影响渗透平衡，引起细胞膨胀并溶解，抑制靶标害虫取食并最终导致其死亡(Hofte和Whiteley,1989)。尽管与Cry类蛋白杀虫效果相似，但时间上明显迟缓。通过饲喂小地老虎(Vip3敏感昆虫)后，其肠道上皮柱状细胞在24hr后仅出现膨胀，48h后柱状细胞持续恶化，但杯状细胞仍与基膜相连，直至72h后昆虫才因上皮层脱落出现死亡。并且Vip3类蛋白还存在明显的剂量效应，对吞食含有Vip3A的饲料的敏感害虫的组织解剖学分析发现，低浓度即可引起昆虫麻痹，但真正引起肠道上皮细胞破坏的杀虫效果则需要十倍以上的高浓度蛋白存在(Yuetal.,1997)。因此，如何提高Vip3A蛋白在植物中的表达量，使其能够真正起到杀虫作用是其能否大规模应用的重要条件。与Cry类蛋白无交叉杀虫活性的Vip3A蛋白在转基因农作物上的应用具有能有效增强其对靶标昆虫的毒力，扩大杀虫谱，延缓昆虫抗性的产生等一系列优势，因此对其改造工作也逐渐为研究者关注。但大多数研究仅仅局限于提高Vip3A蛋白对某种特定害虫的毒性。例如，Vip3Aa11氨基端的第9位丝氨酸突变为天冬酰胺(S9N)、第193位丝氨酸突变为苏氨酸(S193T)后，对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和棉铃虫(Heliothisarmigera)的杀虫活性有明显提高(Liuetal.,2017)。Chi等(2017)将Vip3Aa的543位丝氨酸突变为天冬酰胺(S543N)、686位丝氨酸突变为精氨酸(S686R)，获得的突变体对甜菜夜蛾杀虫活性分别提高5倍和8.98倍。对Vip3A蛋白进行改造，通过提高其在转基因植物中稳定性，进而获得高表达Vip3A蛋白的转基因植物使其适用于农业生产的研究鲜有报答。尽管通过大量遗传转化及对所获得的海量转基因材料进行大量的分子检测工作能够在一定程度上解决转基因植物材料中的外源蛋白表达量低的问题，但是通过对目的蛋白的改造，获得本身适宜在植物细胞及组织中具有高表达特性的人工蛋白显然能节省大量的研发成本，并在相同研发成本情况下获得更高的表达量的植物转基因株系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种经人工改造的mVIP3An18基因，其编码蛋白的N段去除了3个天然的氨基酸并添加了46个新的氨基酸，使其在玉米细胞中的结构稳定性大大加强，避免了其被玉米内源蛋白酶的降解。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供一种抗虫蛋白mVIP3An18，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术进一步保护编码上述蛋白的基因，其碱基序列如SEQIDNo.2所示，该编码基因是通过以下思路设计并合成的：1)首先根据收集的天然或异源表达的各种蛋白在玉米细胞中的表达量信息进行训练，并建立向量机算法模型，利用该模型分析模拟天然VIP3A蛋白在玉米叶细胞中的稳定性与其N端氨基酸组成的关系；2)根据分析结果首先我们对Genbank上已发表的天然VIP3A蛋白的氨基酸序列进行N端的3个可能导致其在玉米细胞中被泛素化酶识别的氨基酸移除，以初步降低其在玉米细胞中异源表达存在的稳定性差、表达产物含量低的风险；3)根据模拟结果进行新的参数设定，利用穷举法模拟通过在天然VIP3A蛋白N端添加若干不同组成的氨基酸序列其在玉米细胞中的异源表达水平变化，根据得分高低进行预测，得出一段由添加了46个氨基酸的新的序列信息结构最为稳定，为SEQIDNo.1所示氨基酸序列；4)根据SEQIDNo.1所示氨基酸序列，利用GeneDesigner设计其编码基因，对于氨基酸的编码密码子采用玉米密码子偏好性进行最优先选择，再通过GeneDesigner内置算法工具去除富含AT的结构域、疑似内含子结构、连续存在的重复结构域，以及其内部出现的可能会影响该基因在未来商业化应用过程中用于植物表达载体构建的常用内切酶识别位点，进行优化，优化后的基因序列见SEQIDNO.2所示；所述位点包括但不限于：BamHI、BglII、BsaI、BsiWI、BsmBI、BspEI、BstEII、ClaI、DraIII、EcoRI、EcoRV、HindIII、HpaI、KpnI、MluI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、NsiI、PacI、PciI、PmeI、PmlI、PsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SacII、SalI、SfiI、SmaI、SmaBI、SpeI、SphI、SspI、StuI、Swai、XbaI、XhoI、XmaI和XmnI酶切位点；5)通过化学合成法对上述优化后的基因序列进行全基因合成，并插入到克隆载体pUC119中，进行保存。本专利技术进一步保护上述编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用。本专利技术进一步保护含有上述编码基因的表达载体。进一步的，所述表达载体可选用商业化植物表达载体pCAMBIA3301。本专利技术进一步保护携带上述载体的携带上述的载体玉米转基因愈伤组织。本专利技术进一步保护上述编码基因在制备重组抗虫蛋白mVIP3An18中的应用。本专利技术进一步保护上述抗虫蛋白mVIP3An18在制备抗虫剂中的应用。作为本专利技术的进一步改进，所述抗虫剂为草地贪夜蛾幼虫抗虫剂。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术中经人工改造的杀虫蛋白amVIP3Aa，其N段去除了3个天然的氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗虫蛋白mVIP3An18，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗虫蛋白mVIP3An18，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.编码权利要求1所述蛋白的基因。


3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的碱基序列如SEQIDNo.2所示。


4.根据权利要求2所述编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用。


5.含有权利要求2所述编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：舍亚涛，高雪飞，高翔，舍强，陈微林，郭建强，张宇，赵海菊，马玉龙，孙志军，
申请(专利权)人：九圣禾种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65