一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L‑哌啶甲酸的方法，包括如下步骤：将具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂接种于含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中培养，得到第一发酵液；向第一发酵液中加入阿拉伯糖培养，得到第二发酵液；向第二发酵液中加入异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导表达发酵，得到第三发酵液；将第三发酵液进一步发酵，即得含有L‑哌啶甲酸的的发酵液。本发明专利技术利用金属‑有机框架材料与凝胶微球的组合，兼多种孔道尺寸与结构的优点，有效提升了对于L‑哌啶甲酸的吸附效果。

【技术实现步骤摘要】
一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法
本专利技术属于全细胞催化、L-哌啶甲酸生产、材料吸附分离领域，涉及一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法。
技术介绍
L-哌啶甲酸作为含氮杂环化合物，是多种免疫抑制剂等药物的关键前体。这些药物多为手性杂环聚酮类分子，L-哌啶甲酸是其中核心的构件之一，也是此类化合物天然代谢合成、人工生产合成过程的不可替代的部分。例如，L-哌啶甲酸参与合成抗肿瘤药物VX710、苦马豆碱等，抗生素山卓霉素、万可霉素等，因此，其在医学及生理学等领域具有非常高的应用价值。对哌啶甲酸合成的研究除了可以增加哌啶甲酸产量、加强这些药物的生产，还有可能促进以哌啶甲酸为核心结构的一大类药物的作用机制研究，甚至促进分子结构类似化合物的新药的开发。随着药物合成工业的不断发展，人们对这类关键小分子需求也在不断增加。在2001年以前，L-哌啶甲酸主要通过化学合成来生产。然而，使用化学法合成光学纯的手性有机物通常都不是一个容易解决的问题。化学法合成L-哌啶甲酸只能通过直接以L-赖氨酸等手性物质为反应物、引入手性基团等方法。化学合成法步骤繁杂，并且过程存在污染环境的问题。更加安全、绿色、经济的生物合成L-哌啶甲酸的方法开始受到业界的关注。利用生物法制备L-哌啶甲酸具有反应步骤较少，过程绿色环保等有优点，但生物法目前仍因产量相对较低、操作步骤繁杂等缺点，使其尚且不适用于大规模工业化生产L-哌啶甲酸。因此，需要开发一种新的方法以解决现有技术存在的问题。专利技术内容专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中生物法催化生产L-哌啶甲酸过程中产量低、菌体耐受性低、产物分离困难、连续化生产步骤繁琐的问题，提供一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法，该方法对于L-哌啶甲酸的产量有了明显的提升，并且显著简化了生物催化过程中的产物分离过程。专利技术思路：如图1所示，利用海藻酸钠凝胶掺杂纳米金属-有机框架材料与大肠杆菌共混合制备出多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，即构建多级孔道的凝胶微球对大肠杆菌进行包裹固定大肠杆菌后，利用表面活性剂或有机试剂对大肠杆菌细胞膜进行通透性修饰，提升大肠杆菌产L-哌啶甲酸的催化活性，其次掺杂了纳米金属-有机框架材料的凝胶微球，可以利用多级孔道结构对L-哌啶甲酸进行选择性富集，进而简化产物回收过程。本专利技术通过材料设计和大肠杆菌生物催化的过程研究，建立多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，同时兼顾了L-哌啶甲酸的生产和分离。一，利用海藻酸钠凝胶掺杂纳米金属-有机框架材料，实现了对催化反应过程中L-哌啶甲酸的选择性富集；二，多孔道吸附凝胶结合大肠杆菌，提高了大肠杆菌的催化生产L-哌啶甲酸的产量；三，实现生物法连续化生产L-哌啶甲酸，减少操作步骤，对于提高L-哌啶甲酸的产量具有实际应用价值。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法，包括如下步骤：(i)将具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂按照0.08～0.16g/mL的用量接种于含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中培养，得到第一发酵液；(ii)向第一发酵液中加入阿拉伯糖培养，得到第二发酵液；(iii)向第二发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达发酵，得到第三发酵液；(iv)将第三发酵液进一步发酵，即得含有L-哌啶甲酸的的发酵液。步骤(i)中，所述的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂的制备方法为：(1)将硫酸钴类化合物和咪唑类化合物搅拌混合，离心，所得沉淀干燥，得到纳米金属有机框架；(2)将步骤(1)得到的纳米金属有机框架通过水与海藻酸钠混合均匀，得到掺杂凝胶的纳米金属有机框架；(3)将步骤(2)得到的掺杂凝胶的纳米金属有机框架与大肠杆菌溶液混合，搅拌，得到掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架；(4)向步骤(3)得到的掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架中滴加金属离子溶液，静置，得到直径为1～3mm的多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌的微球；(5)将步骤(4)得到的微球加入培养基中培养，搅拌；再向其中加入甜菜碱，搅拌，取出微球，即得多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。步骤(1)中，所述的硫酸钴类化合物优选为CoSO4·6H2O；所述的咪唑为2-甲基咪唑、咪唑或其他咪唑衍生物；所述的溶液中，溶剂为甲醇，硫酸钴类化合物的浓度为0.1-0.8mmol/mL，优选为0.4mmol/mL，咪唑类化合物的浓度为0.5-2.5mmol/mL，优选为1.6mmol/mL；所述的搅拌混合为在室温下500rpm搅拌6-36h，优选为12h；所述的离心为6000rpm离心15min。步骤(1)中，所述的纳米金属有机框架为ZIF-67、ZIF-8或者其衍生物的其中的一种或者多种。步骤(2)中，纳米金属有机框架与海藻酸钠的质量比为1:10～1：30；纳米金属有机框架与水的质量体积比为0.05～0.25mg/mL；优选地，纳米金属有机框架与海藻酸钠的质量比为1:20；纳米金属有机框架与水的质量体积比为0.1mg/mL。其中，所述的海藻酸钠的分子量为上海国药沪试的海藻酸钠。步骤(2)中，所述的混合均匀为微波加热5～10s至海藻酸钠粉末完全溶解于水中，以500rpm转速搅拌15min至纳米金属有机框架粉末在海藻酸钠凝胶中混合均匀。步骤(3)中，所述的大肠杆菌溶液OD600为20；掺杂凝胶的纳米金属有机框架与大肠杆菌溶液的体积比为1:1～5:1，优选为5:1；所述的搅拌为300rpm，4℃搅拌30min。步骤(4)中，所述的金属离子溶液为含有亚铁离子和钙离子的水溶液，亚铁离子的浓度为20～120mmol/L，优选为60mmol/L，钙离子的浓度为20～120mmol/L，优选为60mmol/L；金属离子溶液与掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架的体积比为100:1～100:25，优选为100:6；滴加速率为1～5滴/s；静置的时间为15～60min，优选为30min。步骤(5)中，将步骤(4)得到的微球按照1g/100mL～10g/100mL，优选为8g/100mL培养基的比加入LB培养基中，于15～35℃下搅拌5～10min，优选为于20℃下搅拌5min，以激活大肠杆菌；再向其中加入100～600mg甜菜碱/8g微球，优选为500mg甜菜碱/8g微球，于15～35℃下搅拌15～60min，优选为于20℃下搅拌30min，取出微球，即得多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。步骤(i)中，所述的具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂为将多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂置于LB培养基中，37℃，100～300rpm培养3h，以让细胞进行少量的繁殖或生长，保证不被表面活性剂损伤的过于严重。步骤(i)中，所述的含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中氯霉素和卡那霉素的含量分别为10～40mg/L和20～60mg/L，优选地，两者的含量分别为34mg/L和50mg/L；具体成分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂接种于含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中培养，得到第一发酵液；向第一发酵液中加入阿拉伯糖培养，得到第二发酵液；向第二发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达发酵，得到第三发酵液；将第三发酵液进一步发酵，即得含有L-哌啶甲酸的的发酵液。/n

【技术特征摘要】
1.一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂接种于含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中培养，得到第一发酵液；向第一发酵液中加入阿拉伯糖培养，得到第二发酵液；向第二发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达发酵，得到第三发酵液；将第三发酵液进一步发酵，即得含有L-哌啶甲酸的的发酵液。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂的制备方法为：
(1)将硫酸钴类化合物和咪唑类化合物搅拌混合，离心，所得沉淀干燥，得到纳米金属有机框架；
(2)将步骤(1)得到的纳米金属有机框架通过水与海藻酸钠混合均匀，得到掺杂凝胶的纳米金属有机框架；
(3)将步骤(2)得到的掺杂凝胶的纳米金属有机框架与大肠杆菌溶液混合，搅拌，得到掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架；
(4)向步骤(3)得到的掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架中滴加金属离子溶液，静置，得到多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌的微球；
(5)将步骤(4)得到的微球加入培养基中培养，搅拌；再向其中加入甜菜碱，搅拌，取出微球，即得多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的溶液中，溶剂为甲醇，硫酸钴类化合物的浓度为0.1-0.8mmol/mL，咪唑类化合物的浓度为0.5-2.5mmol/mL；所述的搅拌混合为在室温下搅拌6-36h。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，纳米金属有机框架与海藻酸钠的质量比为1:10～1：30；纳米金属有机框架与水的质量体积比为0.05～0.25mg/mL。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的大肠杆菌溶液OD6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，许晟，冯娇，
申请(专利权)人：南京凯诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32