一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法技术

本发明专利技术涉及生物降解技术领域，且公开了一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，包括以下步骤：在超净工作台中，将采集的土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为200rpm，将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于赤霉烯酮降解实验，得到铜绿假单胞菌；本发明专利技术利用黑曲霉和铜绿假单胞菌可以降解赤霉烯酮毒素的特性，使其两者相互配合，高效地降解DDGS饲料产品中赤霉烯酮毒素的含量，从而提高DDGS饲料产品的质量，且安全性高，且不会造成污染，利于大规模使用。

【技术实现步骤摘要】
一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法
本专利技术涉及生物降解
，具体为一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法。
技术介绍
赤霉烯酮，又称F-2毒素，是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构，有较强的雌激素活性。该毒素热稳定，并不因长期储存、烘烤或丙酸或霉菌生长抑制剂的加入而受到破坏。赤霉烯酮在人和动物体内积累可诱发一系列雌激素效应症状，包括影响雌性哺乳动物乳房发育、外阴阴道炎、发情周期紊乱、假孕不孕、流产、死胎畸胎等，此外有研究证实，赤霉烯酮还有遗传毒性，细胞毒性，免疫毒性，致肿瘤毒性。赤霉烯酮存在于世界范围的多种谷物作物中，如：玉米、大麦、燕麦、小麦、稻、和高粱。在收获前赤霉烯酮的产生通常没有显著的量的发生，但在合适的环境条件下，易在储藏中的玉米和小谷粒上产生。目前，针对去除DDGS饲料中赤霉烯酮的方法，根据其作用原理可分化学法和物理法，其中物理脱毒法在去除赤霉烯酮毒素的同时也会造成动物饲料营养物质的流失；而化学脱毒法虽然可以脱去一些霉变较严重的谷物饲料，但费时费工，而且对营养成分造成极大的破坏，还可能产生一些对动物健康有害的化学物质。
技术实现思路
（一）解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，具备安全性高，可专一、高效地降解DDGS饲料中的赤霉烯酮毒素，提高DDGS饲料产品的质量。（二）技术方案为实现上述安装方便和防水性好目的，本专利技术提供如下技术方案：一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，包括以下步骤：步骤一：菌的分离1）在超净工作台中，将采集的土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为200rpm；2）将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于赤霉烯酮降解实验，得到铜绿假单胞菌；3）从发酵4天后的酱中用含β-环糊精的PDA培养基定性地分离出酱醅中的非产毒丝状真菌，然后用ELISA方法对所分离菌株的产毒能力进行定量分析，最后筛选出非产毒的霉菌。对能抑制黄曲霉产毒菌进行复筛，筛选出能防治真菌毒素的菌株黑曲霉。步骤二：黑曲霉对赤霉烯酮的降解1）将分离得到的菌株黑曲霉按2%的接种量接种到60ml无菌PDB培养基中，温度设定为28℃，摇床培养5天，摇床转速为200rpm。向发酵液中加入赤霉烯酮使其终浓度达到2ppm，以无菌PDB培养液加赤霉烯酮作为空白对照。步骤三：铜绿假单胞菌降解赤霉烯酮1）将铜绿假单胞菌接种于液体NB培养基中，在温度为37摄氏度和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24小时后，收集培养产物为NS7培养液，用于后续的赤霉烯酮降解实验；2）赤霉烯酮的配制，将5mg赤霉烯酮标准品溶解于25ml色谱纯甲醇中获得浓度为200ppm的赤霉烯酮溶液；3）降解赤霉烯酮，实验组：取10μl浓度为200ppm的赤霉烯酮溶液置于10ml离心管中，加入975μl新鲜MM培养基，使其终浓度为2ppm。加入10μl上述得到的NS7培养液，充分混匀在28摄氏度转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养72h，10000g离心10min去除细胞，收集上清液。对照组：取10μl黑曲霉降解后的赤霉烯酮的溶液加入体积为1ml的含2ppm赤霉烯酮的MM培养基作为对照组。步骤四：色谱检测1)将对照组和实验组的培养基分别培养48小时后，从两组样品中吸取2ml液体加入4ml三氯甲烷，分别萃取3次，氮气吹干后再加1ml流动相[乙腈:水=50:50(v/v)]复溶，过0.22μm的有机滤膜后用高效液相色谱法（HPLC）进行检测；色谱检测条件为：色谱柱：C18柱6mm×150mm×5um；流动相：乙腈：水=50:50；检测温度：25℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：274nm；发射波长：440nm；进样量：20μL；洗脱时间20min；赤霉烯酮的保留时间在6.5±0.5min。（三）有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，具备以下有益效果：该对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，利用黑曲霉和铜绿假单胞菌可以降解赤霉烯酮毒素的特性，使其两者相互配合，高效地降解DDGS饲料产品中赤霉烯酮毒素的含量，从而提高DDGS饲料产品的质量，且安全性高、持续时间长，且不会造成污染，利于大规模使用。具体实施方式下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例一一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，包括以下步骤：步骤一：菌的分离1）在超净工作台中，将采集的土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为200rpm；2）将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于赤霉烯酮降解实验，得到铜绿假单胞菌。步骤二：铜绿假单胞菌降解赤霉烯酮1）将铜绿假单胞菌接种于液体NB培养基中，在温度为37摄氏度和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24小时后，收集培养产物为NS7培养液，用于后续的赤霉烯酮降解实验；2）赤霉烯酮的配制，将5mg赤霉烯酮标准品溶解于25ml色谱纯甲醇中获得浓度为200ppm的赤霉烯酮溶液；3）降解赤霉烯酮，实验组：取10μl浓度为200ppm的赤霉烯酮溶液置于10ml离心管中，加入975μl新鲜MM培养基，使其终浓度为2ppm。加入10μl上述得到的NS7培养液，充分混匀在28摄氏度转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养72h，10000g离心10min去除细胞，收集上清液；对照组：取10μl不接菌的NB培养基加入体积为1ml的含2ppm赤霉烯酮的MM培养基作为对照组。步骤三：色谱检测1)将对照组和实验组的培养基分别培养48小时后，从两组样品中吸取2ml液体加入4ml三氯甲烷，分别萃取3次，氮气吹干后再加1ml流动相[乙腈:水=50:50(v/v)]复溶，过0.22μm的有机滤膜后用高效液相色谱法（HPLC）进行检测；色谱检测条件为：色谱柱：C18柱6mm×150mm×5um；流动相：乙腈：水=50:50；检测温度：25℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：274nm；发射波长：440nm；进样量：20μL；洗脱时间20min；赤霉烯酮的保留时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一：菌的分离/n在超净工作台中，将采集的土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为200rpm；/n将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于赤霉烯酮降解实验，得到铜绿假单胞菌；/n从发酵4天后的酱中用含β-环糊精的PDA培养基定性地分离出酱醅中的非产毒丝状真菌，然后用ELISA方法对所分离菌株的产毒能力进行定量分析，最后筛选出非产毒的霉菌，对能抑制黄曲霉产毒菌进行复筛，筛选出能防治真菌毒素的菌株黑曲霉；/n步骤二：黑曲霉对赤霉烯酮的降解/n1）将分离得到的菌株黑曲霉按2%的接种量接种到60ml无菌PDB培养基中，温度设定为28℃，摇床培养5天，摇床转速为200rpm；/n步骤三：铜绿假单胞菌降解赤霉烯酮/n1）将铜绿假单胞菌接种于液体NB培养基中，在温度为37摄氏度和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24小时后，收集培养产物为NS7培养液，用于后续的赤霉烯酮降解实验；/n2）赤霉烯酮的配制，将5mg赤霉烯酮标准品溶解于25ml色谱纯甲醇中获得浓度为200ppm的赤霉烯酮溶液；/n3）降解赤霉烯酮，实验组：取10μl浓度为200ppm的赤霉烯酮溶液置于10ml离心管中，加入975μl新鲜MM培养基，使其终浓度为2ppm，加入10μl上述得到的NS7培养液，充分混匀在28摄氏度转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养72h，10000g离心10min去除细胞，收集上清液；/n对照组：取10μl黑曲霉降解后的赤霉烯酮的溶液加入体积为1ml的含2ppm赤霉烯酮的MM培养基作为对照组；/n步骤四：色谱检测/n1)将对照组和实验组的培养基分别培养48小时后，从两组样品中吸取2ml液体加入4ml三氯甲烷，分别萃取3次，氮气吹干后再加1ml流动相[乙腈:水=50:50(v/v)]复溶，过0.22μm的有机滤膜后用高效液相色谱法（HPLC）进行检测；/n色谱检测条件为：色谱柱：C18柱6mm×150mm×5um；流动相：乙腈：水=50:50；检测温度：25℃；流速：1ml/min；检测波长：激发波长：274nm；发射波长：440nm；进样量：20μL；洗脱时间20min；赤霉烯酮的保留时间在6.5±0.5min。/n...

【技术特征摘要】
1.一种对DDGS中赤霉烯酮毒素的生物降解方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：菌的分离
在超净工作台中，将采集的土壤样品放在无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，摇床转速为200rpm；
将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于赤霉烯酮降解实验，得到铜绿假单胞菌；
从发酵4天后的酱中用含β-环糊精的PDA培养基定性地分离出酱醅中的非产毒丝状真菌，然后用ELISA方法对所分离菌株的产毒能力进行定量分析，最后筛选出非产毒的霉菌，对能抑制黄曲霉产毒菌进行复筛，筛选出能防治真菌毒素的菌株黑曲霉；
步骤二：黑曲霉对赤霉烯酮的降解
1）将分离得到的菌株黑曲霉按2%的接种量接种到60ml无菌PDB培养基中，温度设定为28℃，摇床培养5天，摇床转速为200rpm；
步骤三：铜绿假单胞菌降解赤霉烯酮
1）将铜绿假单胞菌接种于液体NB培养基中，在温度为37摄氏度和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养24小时后，收集培养产物为NS7培养液，用于后续的赤霉烯酮降解实验；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉国，张楠楠，
申请(专利权)人：海南泓缘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46