一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法及其应用，该培养方法包括以下步骤：S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养至细胞90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；S2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养，再静置培养2‑3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度；本发明专利技术的方法制备的人工皮肤进一步减少创面的深度，提供相对满意的愈合效果。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法及其应用
本专利技术属于生物组织器官修复
，具体涉及一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法及其应用。
技术介绍
正常的皮肤分为三层，角质层、真皮层和皮下组织层，真皮层含有丰富的神经和血管等，成年哺乳动物的真皮不能自发地再生，在缺少移植存活的真皮基质时，成纤维细胞便开始合成不成熟的基质，基质经重塑形成疤痕，部分疤痕收缩皮肤引起疼痛，部分还会影响相近关节活动，对患者的身心健康都有长期影响；市面上已有的脱细胞真皮基质是异体真皮经特殊处理，去除其细胞成分后得到的一种真皮替代品，异体移植最大的问题就是排异反应，而移植皮肤造成排异反应的主要是表皮细胞、真皮中的成纤维细胞和内皮细胞等细胞成分；而非细胞成分的细胞外基质蛋白和胶原(即脱细胞真皮)则无任何免疫活动，可永久地存在异体宿主体内，有效地改善瘢痕形成的皮肤收缩的情况。慢性创面的原因有很多，除了感染及常见的系统性疾病(如糖尿病)，大面积皮肤缺损也是慢性难愈性创面的主要原因，慢性创面治疗时间长，除了给患者造成了躯体及经济上的负担之外，还严重影响到了患者的社会心理健康，因此慢性创面是整形外科乃至整个医学界的难题；目前临床上的常用的修复方法，需要对供区造成损伤，若受区损伤面积较大，则供区可能面临较大损伤和再次出现愈合不良的风险，近些年来，促进慢性创面的研究有了一定的突破，其中干细胞为解决这一难题提供了新的思路。脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是一种来源于中胚层的MSCs，可跨胚层多向分化，同时具有自分泌及旁分泌功能，可以分泌多种细胞因子，减轻炎症反应，促进血管新生，与胚胎干细胞和BMSCs不同，ADSCs的获取途径广泛，且可通过局麻微创等方式获取，不涉及伦理问题；因此已经有研究表明ADSCs可以显著促进创面愈合，研究证实，ADSCs还有抗炎和抗纤维化作用，临床研究发现，ADSCs可显著提高难愈性皮肤溃疡、放射性皮炎、术后皮肤坏死等疾病的治疗效果；但是传统的细胞治疗方法是将ADSCs直接注射至创面组织，但是效果很难达到患者的需求，其可能的原因是由于创面组织处于慢性炎症状态，注射的ADSCs细胞受局部环境影响较大，存活率有限，从而很难发挥促进创面愈合的效应。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供了一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法，培养方法具体包括以下步骤：S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养至细胞70-90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；S2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养，再静置培养2-3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度。进一步地，该培养方法具体包括以下步骤：S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养，用完全培养基培养至细胞70-90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；所述完全培养基为：以DMEM/F12为基础培养基，添加浓度为20-30μg/ml的人纤连蛋白、浓度为5-15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、浓度为10-20ng/ml的人表皮细胞生长因子、浓度为0.5-1.5％的ITS、浓度为4-6％的人血白蛋白、浓度为0.5-1.5％的NEAA、浓度为0.05-0.15μmol/L的氢化考的松、浓度为0.05-0.15％的β-巯基乙醇；S2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养20-40min，摇床转速为40-60r/min，后停止震荡，静置继续培养3-6天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度。其中，ITS(insulin-transferrin-selenium)，包括胰岛素、转铁蛋白、硒溶液三种成分，购自Gibco，NEAA，中文名称非必需氨基酸，购自Gibco；脱细胞异体真皮支架(ADM)是近些年来新兴的组织工程学皮肤，与人体组织有极好的相容性，无任何排异反应，因此常常应用于整形外科的器官再造和组织修复手术中，并取得了满意的手术效果，脱细胞异体真皮支架是皮肤的支架成分，能够为皮肤细胞提供良好的生长环境和“庇护场所”，本专利技术研究发现，ADSCs可以在脱细胞异体真皮支架中得以良好存活并具有相应的生物学活性，将ADSCs与无免疫原性的脱细胞异体真皮支架相结合，所组成的人体组织工程学皮肤不仅能够满足以上要求，脱细胞异体真皮支架本身还能够提供可观的组织容量，可以进一步减少创面的深度，提供相对满意的愈合效果；本专利技术利用ADSCs为脱细胞真皮基质补足了缺失的细胞组分，间充质干细胞与脱细胞异体真皮支架构成组织工程学皮肤能够促进创面愈合，加快移植物炎性反应消退，本专利技术创造了一种负载细胞的脱细胞真皮基质及其相应的临床使用方案，提升了脱细胞真皮基质的治疗效果，该负载细胞的真皮基质可用于深度烧伤创面修复、整形外科的填充功能、眼睑成形术等。优选地，培养方法具体包括以下步骤：S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养，用完全培养基培养至细胞90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；所述完全培养基为：以DMEM/F12为基础培养基，添加浓度为20μg/ml的人纤连蛋白、浓度为5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、浓度为10ng/ml的人表皮细胞生长因子、浓度为0.5的ITS、浓度为4％的人血白蛋白、浓度为0.5％的NEAA、浓度为0.05μmol/L的氢化考的松、浓度为0.05％的β-巯基乙醇；S2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养20min，摇床转速为40r/min，后停止震荡，静置继续培养3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度。进一步地，间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞和宫内膜间充质干细胞中的一种。进一步地，间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，脂肪间充质干细胞悬液的制备方法如下：(1)取脂肪细胞；(2)将所述脂肪细胞放置于试管内，在试管中加入与脂肪组织量相同体积的消化液，所述消化液包括体积比为1:1的胰蛋白酶-EDTA和0.1％的I型胶原酶，将试管密封，放入37℃的恒温摇床中以180-200r/Min的速度震荡消化，分为3层；(3)吸出离心管中的下层液体移入装有完全培养基的新离心管中终止消化，将离心管封闭，离心，分为2层；(4)用吸管吸取新离心管中的上清后去掉，加入完全培养基，轻轻吹打制成细胞悬液；(5)将细胞悬液按照0.5×106/ml的密度接种到培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法，其特征在于，所述培养方法具体包括以下步骤：/nS1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养至细胞70-90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；/nS2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养，再静置培养2-3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度。/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法，其特征在于，所述培养方法具体包括以下步骤：
S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养至细胞70-90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；
S2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养，再静置培养2-3天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度。


2.如权利要求1所述的间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法，其特征在于，所述培养方法具体包括以下步骤：
S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养，用完全培养基培养至细胞70-90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；所述完全培养基为：以DMEM/F12为基础培养基，添加浓度为20-30μg/ml的人纤连蛋白、浓度为5-15ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、浓度为10-20ng/ml的人表皮细胞生长因子、浓度为0.5-1.5％的ITS、浓度为4-6％的人血白蛋白、浓度为0.5-1.5％的NEAA、浓度为0.05-0.15μmol/L的氢化考的松、浓度为0.05-0.15％的β-巯基乙醇；
S2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养20-40min，摇床转速为40-60r/min，后停止震荡，静置继续培养3-6天，培养条件如下：温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％，湿度为饱和湿度。


3.如权利要求1所述的间充质干细胞在脱细胞异体真皮支架上的培养方法，其特征在于，所述培养方法具体包括以下步骤：
S1：间充质干细胞悬液的制备：将间充质干细胞传代培养，用完全培养基培养至细胞90％汇合时，收集P3代细胞，制成间充质干细胞悬液；所述完全培养基为：以DMEM/F12为基础培养基，添加浓度为20μg/ml的人纤连蛋白、浓度为5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、浓度为10ng/ml的人表皮细胞生长因子、浓度为0.5的ITS、浓度为4％的人血白蛋白、浓度为0.5％的NEAA、浓度为0.05μmol/L的氢化考的松、浓度为0.05％的β-巯基乙醇；
S2：附着：将脱细胞异体真皮支架与间充质干细胞悬液放置于超低吸附反应皿中使用完全培养基进行培养，先在37℃条件下震荡培养20min，摇床转速为40r/min，后停止震荡，静置继续培养3天，培养条件如下：温度为37....

【专利技术属性】
技术研发人员：曹毓琳，滕睿頔，张海林，
申请(专利权)人：北京臻溪谷医学研究中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：北京;11