用于疫苗或诊断测试中的鉴定PRRS病毒的肽序列的PRRSV抗原位点制造技术

本发明专利技术提供了ＰＲＲＳＶ分离物的抗原位点。抗原位点是中和性的，保守的，非保守的和构象的，可以引发抗体并且在ＰＲＲＳＶ的ＯＲＦ４和ＯＲＦ７编码的蛋白质ＧＰ↓［４］和Ｎ上存在。这些位点鉴定的肽序列可以掺入抗ＰＲＲＳ的疫苗和ＰＲＲＳ的诊断测试中。同时，可以开发在设计消灭猪群中ＰＲＲＳ的计划中在标记疫苗之后使用的区别测试。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及神秘猪疾病(Mystery Swine Disease)的病原体PRRS病毒，涉及在PRRS病毒中鉴定的肽序列，并且涉及在疫苗和诊断测试中掺入这些序列。PRRS病毒(PRRSV)是一种目前称为猪生殖和呼吸综合症(PRRS)的猪疾病的病原体。该病毒是在美国大约自1987年，在欧洲大约自1990年发现的猪疾病的病原体，该病最初以各种名称如神秘猪疾病，猪不育和呼吸综合症等许多其它名称而闻名。病毒本身也有许多名称，如Lelystad病毒(LV)，SIRS病毒和许多其它名称，但现在大多数命名为猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)。它在猪中引起流产和呼吸窘迫并且首先于1991年在欧洲分离(EP专利587780，美国专利5,620,691)，随后在美国和许多其它国家分离。PRRSV是含有正链RNA基因组的小的有包膜病毒。PRRSV优选地在巨噬细胞中生长，除了巨噬细胞，PRRSV可以生长在细胞系CL2621和其它从猴肾细胞系MA-104克隆的细胞系(Benfield等人，兽医诊断研究杂志4；127-133，1992)。在1993年测序了PRRSV的基因组，约15kb的多聚腺苷酸化RNA(Meulenberg等人，病毒学192；62-74，1993)。核苷酸序列，基因组构成和复制方案表明PRRSV与一组命名为动脉炎病毒的小的有包膜正链RNA病毒相关，这组病毒包括乳酸脱氢酶升高病毒(LDV)，马动脉炎病毒(EAV)，和猴出血热病毒(SHFV)。这些病毒具有相似的基因组构成，复制方案，形态学，和病毒蛋白质的氨基酸序列。动脉炎病毒含有12.5到15kb的基因组并且在复制过程中合成六个亚基因组RNA的一个3’嵌套组合。这些亚基因组RNA含有起源于病毒基因组的5’末端的引导序列。ORF 1a和1b含有约2/3的病毒基因组，并且编码依赖RNA的RNA聚合酶。六个较小的ORF，ORF2到7位于病毒基因组的3’末端，ORF2到6似乎是编码包膜蛋白而ORF7编码核衣壳蛋白(Meulenberg等人，病毒学206；155-163，1995)。PRRSV是第一个已被证明ORF2到7编码的所有六个蛋白质均与病毒粒子相关的动脉炎病毒。15kDa N蛋白(ORF7编码)和18kDa整合膜蛋白M(ORF6)不是N糖基化的，而29-30kDa GP2蛋白质(ORF2)，45-50kDa蛋白质GP3蛋白(ORF3)，31-35kDa GP4蛋白(ORF4)，和25kDa蛋白质GP5(ORF5)是N糖基化的。在细胞外病毒和用PRRSV的北美分离物ATCC-VR2332，和其它PRRSV的分离物感染的细胞的裂解物中也已经检测到这些蛋白质(PRRSV的其它分离物例如是CNCM I-1140，ECACC V93070108，CNCM I-1387，CNCM I-1388，ATCC-VR2402，ATCC-VR2429，ATCC-VR2430，ATCC-VR2431，ATCC-VR2475，ATCC-VR2385，但许多其它的也是已知的)。我们先前描述了特异于GP3，GP4，M和N的一系列特异于PRRSV的MAbs的分离和定性(van Nieuwstadt等人，病毒学杂志，70，4767-4772，1996)。令人感兴趣的是，抗GP4的MAbs是中和的，表明至少部分蛋白质暴露于病毒粒子表面。另外，大多数抗N的Mabs与测试的所有PRRSV分离物反应。在世界的大多数地区PRRS本身是养猪业的主要关心的问题。在猪群中导入PRRSV将引起严重的经济损失。许多兽医和实验室广泛实践了抗PRRS的诊断测试。大多数诊断测试如IPMA，IFT，IFA，ELISA，均含有适当的检测工具，如缀合酶，或荧光素和其它底物，这些诊断测试中利用了起源于PRRSV的抗原和抗PRRSV的抗体之间的相互作用以便测量生物样品如血液，血清，组织，组织液体，灌洗液体，尿，粪便中PRRSV抗原或抗PRRSV的抗体的存在，这些生物样品是从待测试的动物(如猪)中取样的。为了诊断PRRS，用于这些诊断测试，或诊断试剂盒或测试中的抗原和/或抗体仅由它们的起源或它们与PRRSV的反应性确定。通常这对于筛选测试是足够的，其中并未明显需要高度特异性或敏感性。但是，PRRS的连续传播已经引起养猪业的极大关注，以至于认为需要从整个猪群，或甚至从养猪的整个地区或国家消灭PRRS。这一需要的一个明显的例子是在丹麦建议的涉及PRRS的消灭计划。如果决定完全消灭PRRS，那么需要比今天所用的测试展示更高的特异性或敏感性的诊断测试。同时广泛实践了抗PRRS的免疫接种。已知的几个例子是所使用的修饰的活疫苗，同时灭活疫苗也是已知的。但是，通常在活疫苗因此活PRRS疫苗中存在问题，因为这些疫苗具有传播到非接种猪的趋势，从而传播而不是减少猪群中可检测的感染，因此是与完全消灭相反。如果利用了与野生型病毒血清学不同的株系标记疫苗，这一问题将大大降低。另外的缺点是活疫苗有时候在接种的猪中由于未确定的抗原成分引起过敏性反应。虽然通常报道灭活疫苗在接种的猪中诱导保护性，并具有不会从猪传播到猪的额外优点，但是灭活疫苗的一个缺点是在一个剂量的疫苗中很难达到足够的抗原量以引发可测量的和保护性的免疫应答。尤其是可以在猪中诱导可测量的中和抗体效价的灭活疫苗是有益的，因为在接种的猪群中测量这些中和抗体将有助于了解猪群中接种获得的保护水平。另外，如果成功地汇集了必要的抗原量，也意味着在疫苗中也存在更多其它未确定的抗原，也可以产生如上所述的过敏性反应。在这一意义上，知道PRRSV上的哪个特异位点参与了中和反应，从而设计掺入引发中和抗体需要的重要肽序列的更好的适当的疫苗是有益的。目前利用的起源于在美国分离的PRRSV分离物的疫苗的缺点在于这样的疫苗，尽管对PRRSV的欧洲分离物完全保护性抵抗并有免疫交叉反应，但如含有仍未确定的可以从PRRSV的欧洲分离物中区别出来的表位或抗原位点。另一方面，尽管具有抗PRRSV的美国分离物的完全保护性和免疫性交叉反应，但起源于欧洲分离的PRRSV分离物的活疫苗含有类似的仍未确定的可以从PRRSV的美国分离物中区别出来的表位或抗原位点。如果可以获得的血清学测试能够区别(基于PRRSV分离物之间的小的表位差异)用美国起源的疫苗接种或由PRRSV的欧洲野生型感染的猪(接种的或未接种的)，或可以区别接种欧洲起源的疫苗或感染美国野生型PRRSV的猪(接种的或未接种的)，那么可以开发标记疫苗和相应的诊断测试(掺入所述的区别表位或抗原位点)，相信可以用于PRRS的消灭计划。例如，在丹麦，可以利用美国起源的疫苗接种并且测量在丹麦猪中仅抗欧洲野生型PRRSV的独特表位并且与美国毒株没有交叉反应的抗体系列。这将能够明确地检测和随后除去丹麦猪群中野生型感染的猪。目前，由于在PRRSV分离物之间存在广谱的免疫交叉反应性，这样的区别是不可能的。毫无疑问这样的联合接种测试程序将是消灭PRRS的基础，并且如果需要，在疫苗和/或诊断测试中使用区分性的PRRSV抗原位点，它也可以用于其它国家。本专利技术提供了能改良灭活或减毒的疫苗或重组DNA技术起源的疫苗的含有PRRSV的肽序列的抗原位点，以及能改良诊断方法，测试和试剂盒的抗原位点以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
引发中和抗体的肽，它含有起源于对应于ＰＲＲＳＶ的蛋白质ＧＰ４的中和位点的氨基酸序列的至少７到４０个氨基酸残基的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼保罗范尼乌施塔特，扬朗厄费尔德，扬内克莫伊伦贝格，
申请(专利权)人：农业技术研究基金会，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]