一种液相色谱串联质谱法检测大蜜蜂MRJP1及其在鉴别大蜜蜂蜂蜜真实性方面的应用制造技术

本发明专利技术涉及食品检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱法检测大蜜蜂MRJP1及其在鉴别大蜜蜂蜂蜜真实性方面的应用。该方法可以为大蜜蜂蜂蜜的鉴别与真实性评价提供技术和方法参考，同时为保护大蜜蜂这一濒危物种，禁止销售大蜜蜂蜂蜜提供了科技支撑和方法参考。本发明专利技术提供的大蜜蜂蜂蜜中MRJP1的检测方法具有特征强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，尤其适用于大蜜蜂蜂蜜的真实性鉴别。该方法为执法机构遏制大蜜蜂蜂蜜的供销提供了方法支撑，同时为保护大蜜蜂这一濒危种群和维护蜜蜂基因多态性具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱串联质谱法检测大蜜蜂MRJP1及其在鉴别大蜜蜂蜂蜜真实性方面的应用
本专利技术涉及食品检测领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱法检测大蜜蜂MRJP1及其在鉴别大蜜蜂蜂蜜真实性方面的应用。
技术介绍
大蜜蜂(Apisdorsata)为亚洲特有的一种野生传粉昆虫，隶属于膜翅目蜜蜂科蜜蜂属。大蜜蜂的个体较蜜蜂属其它蜜蜂偏大，故称为大蜜蜂；又因其蜂巢单脾成排，悬挂于木棉树等树干之下，俗称大排蜂或大挂蜂。迄今为止，大蜜蜂尚未能驯化，全为野生蜂，性格较为凶猛。它主要分布于东南亚和南亚地区，我国云南、广西和海南等地区也有分布。大蜜蜂是热带地区非常重要的传粉昆虫，很多果树和农作物都依靠其传粉，如荔枝、柚子和芒果等，它在保障热带生物多样性及作物产量中有不可或缺的作用。但受全球气候变化、人类活动和生境恶化等因素的影响，其种群数量日益减少。大蜜蜂蜂巢大，产蜜量高，蜂蜜品质优良、口感味道鲜美，且含有有丰富的营养价值，深受云南等当地人们的喜爱，其售价高达数百元每斤，致使采蜜人大肆猎取大蜜蜂的蜂蜜。近年来，随着网络销售的兴起，以及人们出于吃野味的好奇心驱使，大蜜蜂蜂蜜的销售供不应求。由于大蜜蜂全部为野生，难以人工驯化，职业猎蜜的人的涌现极大的破坏了大蜜蜂的蜂巢，导致大蜜蜂种群数量锐减，有些地方甚至达濒危程度。保护大蜜蜂种群，拒绝购买食用大蜜蜂蜂蜜已经成为社会共识。由于大蜜蜂蜂蜜与普通蜂蜜在形态上并无显著差异，常规的方法难以辨别大蜜蜂蜂蜜。为了保护大蜜蜂这一濒危种群，维持蜜蜂基因的多样性，亟需在立法层面保护这一物种。在执法过程中，需要对供销的大蜜蜂蜂蜜样本进行真实性鉴别，从而为后续执法提供依据。此外，受利益驱使，部分商家会采用普通蜂蜜冒充大蜜蜂蜂蜜进行售卖，谋取高额利润，这不仅欺骗了消费者，而且助长了人们消费大蜜蜂蜂蜜的习惯。当前，我国并未制定有关大蜜蜂蜂蜜的鉴别方法和真实性评价指标，这为市场上大蜜蜂蜂蜜的掺假售价乱像提供了可乘之机。大蜜蜂蜂蜜同普通蜂蜜一样，都是由蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或分泌物，与自身分泌物相混合，经充分酿造储存在蜂巢中的天然甜味食品。因此，蜂蜜中来自蜜蜂的分泌物能够用来指示酿制蜂蜜的蜜蜂品种。众多科学研究表明，蜜蜂酿制蜂蜜过程中混入的分泌物主要有王浆主蛋白(MRJPs)和多种酶类等物质。蜜蜂属中不同品种的蜜蜂经过千万年的进化，其同源性蛋白质MRJPs的部分氨基酸序列发生一定的变化，基于此变化，可以用来指示酿制蜂蜜的蜜蜂品种。
技术实现思路
研究发现，大蜜蜂蜂蜜中MRJP1的含量相对恒定且丰度最高，据此，本专利技术重点围绕MRJP1进行研究，开发的特征肽段为大蜜蜂蜂蜜的鉴别与真实性评价提供技术和方法参考，同时为保护大蜜蜂这一濒危物种，禁止销售大蜜蜂蜂蜜提供了科技支撑和方法参考。具体而言，本专利技术的第一目的在于提供一种用于检测大蜜蜂MRJP1的特征肽段，所述特征肽段的序列为：ENAILSGEYDYTK（SEQIDNo.1）。本专利技术的第二目的在于提供所述的特征肽段在检测大蜜蜂MRJP1中的应用。具体的，本专利技术首先提供一种鉴别大蜜蜂蜂蜜的方法，该方法包括：检测蜂蜜样品中是否含有所述的特征肽段；若含有所述特征肽段，则判定所述蜂蜜样品中含有大蜜蜂蜂蜜；若不含有所述特征肽段，则判定所述蜂蜜样品中不含有大蜜蜂蜂蜜。本专利技术进一步提供一种检测大蜜蜂MRJP1的方法，包括：在蜂蜜样品中检测序列为ENAILSGEYDYTK的特征肽段。作为优选，采用液相色谱串联质谱进行所述检测，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z751.85410([M+2H]2+)的质荷比；子离子包含质荷比为m/z875.37814，m/z962.41017的子离子，其允许偏差在5ppm以内。作为优选，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：ENAILSGEYDYTK*，K*表示精氨酸中所有C置换为13C，所有N置换为15N；所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z757.86606([M+2H]2+)的质荷比；子离子包含质荷比为m/z886.39423和m/z973.42626的子离子，其允许偏差在5ppm以内。蜂蜜样本中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特征，方可肯定所求的该蜂蜜样本中的特征肽段ENAILSGEYDYTK含量可信，可以根据此含量的高低鉴别蜂蜜质量。作为优选，所述蜂蜜样品的前处理包括：对待测蜂蜜中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解。作为优选，采用UHPLC-QExactiveplus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特征和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。本专利技术还提供一种用于检测大蜜蜂MRJP1的试剂盒，标准物质包括所述的特征肽段。作为优选，所述标准物质还包括所述特征肽段的内标肽段，所述内标肽段为：ENAILSGEYDYTK*，K*表示精氨酸中所有C置换为13C，所有N置换为15N。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术的特征肽段为大蜜蜂蜂蜜的鉴别与真实性评价提供了技术和方法参考，同时为保护大蜜蜂这一濒危物种，禁止销售大蜜蜂蜂蜜提供了科技支撑和方法参考。借由该特征肽段，本专利技术提供的大蜜蜂蜂蜜中MRJP1的检测方法具有特征强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益具有一定的现实意义。附图说明图1为UHPLC-QExactiveplus提取的MRJP1的特征肽段ENAILSGEYDYTK的离子流图。图2为UHPLC-QExactiveplus检测的MRJP1的特征肽段ENAILSGEYDYTK的质谱图。图3为UHPLC-QExactiveplus检测的MRJP1的特征肽段ENAILSGEYDYTK的二级碎片质谱图。图4为UHPLC-QExactiveplus提取的同位素标记的内标(IS)肽段ENAILSGEYDYTK*(K*-13C6,15N4)的离子流图。图5为UHPLC-QExactiveplus检测的同位素标记的内标(IS)肽段ENAILSGEYDYTK*(K*-13C6,15N4)的质谱图。图6为UHPLC-QExactiveplus检测的同位素标记的内标(IS)肽段ENAILSGEYDYTK*(K*-13C6,15N4)的二级碎片质谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中涉及的仪器与试剂：1.超高效液相色谱串联四极杆/高分辨静电轨道阱质谱仪(UHPLC-QExactivePlus)，美国ThermoFisherScientific公司；2.台式低温离心机(Micr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于液相串联质谱检测大蜜蜂MRJP1的方法，其特征在于，在蜂蜜样品中检测序列为ENAILSGEYDYTK的特征肽段。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于液相串联质谱检测大蜜蜂MRJP1的方法，其特征在于，在蜂蜜样品中检测序列为ENAILSGEYDYTK的特征肽段。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z751.85410的质荷比；子离子包含质荷比为m/z875.37814，m/z962.41017的子离子，其允许偏差在5ppm以内。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用同位素内标法对所述特征肽段进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：ENAILSGEYDYTK*，K*表示精氨酸中所有C置换为13C，所有N置换为15N；所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z757.86606的质荷比；子离子包含质荷比为m/z886.39423和m/z973.42626的子离子，其允许偏差在5ppm以内。


4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述蜂蜜样品的前处理包括：对...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，傅怡，蔡冬梅，周金慧，杨宇晖，张金震，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11