一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及基因工程和分子遗传育种技术领域，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用。本发明专利技术提供的CRISPR/Cas9基因编辑方法包括向原核期胚胎中导入基因编辑核酸的步骤，所述基因编辑核酸包括Cas9 mRNA和sgRNA；所述基因编辑核酸中，所述Cas9 mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：20。本发明专利技术提供的基因编辑方法，显著提高了双等位基因突变的效率，进而有效降低了基因编辑嵌合个体的比例，提高了双等位基因突变个体的比例，对于目标性状动物的构建和遗传育种具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用
本专利技术涉及基因工程和分子遗传育种
，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9技术是一种RNA介导的基因组编辑技术，能对基因进行精确性敲除、敲入和替换等，从而实现研究基因功能、移除或者修复靶向基因的目的。CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成：sgRNA和Cas9蛋白。sgRNA由CRISPRRNA(crRNA)与反式激活crRNA(trans-activatingcrRNA，tracrRNA)组成，crRNA包括能够与tracrRNA配对，形成双链RNA结构的序列，还包括能够与靶基因目标区域互补的序列，并以此识别靶序列。在实际应用时，多将crRNA和tracrRNA嵌合成单链向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)。CRISPR/Cas9基因编辑系统在进行基因编辑时，Cas9蛋白先与sgRNA形成复合体，该复合体识别目标基因的PAM序列(NGG序列)，Cas9蛋白与PAM序列旁的+1位核苷酸发生相互作用，促使双链DNA解旋，实现Cas9蛋白对目标区域的切割。基因组双链DNA断裂处的修复方式主要有非同源末端连接和同源介导的双链DNA修复。非同源末端连接是一种错误率极高的修复方式，读框移码的插入或删除，导致基因功能丧失。同源介导的双链DNA修复虽然所占比例不足10％，但能在目标位点精确地插入期望序列，可用于精确定点编辑或者基因敲入。>CRISPR/Cas9系统在进行动物的基因编辑时，通常采用直接将翻译产生Cas9蛋白的Cas9mRNA与sgRNA通过显微注射的方式导入原核胚中，但获得动物突变体会存在马赛克现象。所谓“马赛克现象”是指将CRISPR/Cas9系统应用于多细胞生物的受精卵基因编辑时，由于受精卵会分裂成不同的卵裂球，而Cas9蛋白对不同卵裂球的编辑能力和修复方式可能不同，从而导致同时带有编辑细胞与未编辑细胞的嵌合个体的出现，进而影响了动物基因编辑效率和目标性状动物的获得。因此，亟需开发提高双等位基因突变个体的比例，降低嵌合个体所占比例的CRISPR/Cas9基因编辑方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用。在利用CRISPR/Cas9系统进行多细胞生物的受精卵或胚胎细胞的基因编辑时，由于细胞分裂过程中，Cas9系统对于不同细胞的编辑效率和修复方式可能不同，导致等位基因的突变效率差异，最终导致同时带有基因编辑细胞和未编辑细胞的嵌合个体的出现，影响了多细胞生物的基因编辑效率和双等位基因突变的目标性状个体的获得。专利技术人在研究过程中发现，通过提高常规使用的sgRNA和Cas9mRNA导入细胞的摩尔浓度比例，可以显著提高双等位基因编辑的效率。首先，本专利技术提供一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法，所述方法包括向原核期胚胎中导入基因编辑核酸的步骤，所述基因编辑核酸包括Cas9mRNA和sgRNA；所述基因编辑核酸中，所述Cas9mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：20。为得到更优的双等位基因突变效率，所述基因编辑核酸中，所述Cas9mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：15。为得到更优的双等位基因突变效率，同时尽量减少导入核酸对细胞的影响，本专利技术中，所述导入细胞的Cas9mRNA的摩尔浓度为5～8nmol/L。所述sgRNA的摩尔浓度为50～120nmol/L。本专利技术中，所述导入Cas9mRNA和sgRNA为同时导入。本专利技术中，所述导入为采用显微注射的方式导入。所述包含Cas9mRNA和sgRNA的基因编辑核酸的体积可以在本领域允许的注射体积范围内选择。作为本专利技术的一种实施方式，采用显微注射的方式同时导入Cas9mRNA和sgRNA，所述Cas9mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：15，所述导入基因编辑核酸中Cas9mRNA的浓度为5～8nmol/L；sgRNA的浓度为50～120nmol/L，导入基因编辑核酸的体积为3-10pL。采用本专利技术所述的Cas9mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例进行基因编辑核酸的导入，对原核期胚胎进行以非同源末端连接方式实现的基因编辑，双等位基因的突变效率均得到显著提高。具体地，本专利技术所述的基因编辑方法包括如下步骤：(1)基因编辑核酸的合成；(2)将基因编辑核酸导入原核期胚胎；(3)基因编辑阳性个体的鉴定。本专利技术中，所述原核期胚胎为非人类哺乳动物原核期胚胎。作为本专利技术的一种实施方式，当所述原核期胚胎来源于绵羊时，所述基因编辑方法包括如下步骤：(1)基因编辑核酸Cas9mRNA和sgRNA的体外转录合成；(2)供体绵羊超数排卵后进行体外输精，获取原核期胚胎；(3)将Cas9mRNA和sgRNA通过显微注射导入原核期胚胎；(4)将注射Cas9mRNA和sgRNA的胚胎移植至受体绵羊中；(5)对受体绵羊产出的羔羊个体进行基因编辑阳性个体的鉴定。CRISPR/Cas9基因编辑方法在哺乳动物胚胎中的原理和作用过程十分相似，因此，本专利技术提供的CRISPR/Cas9基因编辑方法适用于所有非人类哺乳动物的原核期胚胎，例如：鼠、猪、牛、羊、或猴等。进一步地，本专利技术还提供所述基因编辑方法在如下任意一方面的应用：(1)在制备基因编辑动物中的应用；(2)在动物遗传育种中的应用；(3)在提高双等位基因编辑效率中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术在利用CRISPR/Cas9系统进行非人类哺乳动物原核期胚胎的基因编辑时，通过采用特定摩尔浓度比例的Cas9mRNA和sgRNA导入胚胎，显著提高了双等位基因突变的效率，进而有效降低了基因编辑后代中嵌合个体的比例，提高了双等位基因突变个体的比例；同时，整体的基因编辑效率也有所提高。本专利技术提供的基因编辑方法对于目标性状动物的制备和遗传育种具有重要的应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例1中MSTN基因的两个sgRNA打靶位点(Cr1和Cr2)的结构示意图，其中，sgRNA序列包括与靶点对应的crRNA序列以及tracrRNA序列。图2为本专利技术实施例1中FGF5基因sgRNA打靶位点的结构示意图，其中方框的位置是sgRNA打靶的位置(Cr3)；方框内的序列为PAM区段，sgRNA包括靶点对应的crRNA序列和tracrRNA序列。图3为本专利技术实施例2中Cas9mRNA及sgRNA的体外转录产物电泳图，其中，A为Cas9加帽(Cas9untailed)及加poly(A)尾巴(Cas9tailed)转录后的纯化回收条带；B为转录后的sgRNA的纯化回收条带，Cr1、Cr2为针对MSTN基因的两个打靶位点的sgRNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法，其特征在于，包括：向原核期胚胎中导入基因编辑核酸；所述基因编辑核酸包括Cas9 mRNA和sgRNA；所述基因编辑核酸中，所述Cas9mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：20。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法，其特征在于，包括：向原核期胚胎中导入基因编辑核酸；所述基因编辑核酸包括Cas9mRNA和sgRNA；所述基因编辑核酸中，所述Cas9mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：20。


2.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述Cas9mRNA和sgRNA的摩尔浓度比例为1：10～1：15。


3.根据权利要求1或2所述的基因编辑方法，其特征在于，所述Cas9mRNA的摩尔浓度为5～8nmol/L；
和/或，
所述sgRNA的摩尔浓度为50～120nmol/L。


4.根据权利要求1～3任一项所述的基因编辑方法，其特征在于，所述导入Cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：连正兴，李岩，邓守龙，刘国世，连玲，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11