一种III型类人胶原蛋白及其编码基因、重组菌与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种III型类人胶原蛋白及其编码基因、重组菌与应用，本发明专利技术提供一种新型的III型类人胶原蛋白，以胶原蛋白特征序列Gly‑X‑Y为基础设计了一段III型类人胶原蛋白基因，并将构建好的表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌可成功表达分子量为13.1kD的类人胶原蛋白。本发明专利技术的III型类人胶原蛋白亲水性好，可随意组装形成大分子量的类人胶原蛋白，并且抗氧化活性较高。

【技术实现步骤摘要】
一种III型类人胶原蛋白及其编码基因、重组菌与应用
本专利技术涉及一种III型类人胶原蛋白及其编码基因、重组菌与应用，属于基因工程

技术介绍
胶原蛋白是广泛分布于动物结缔组织的一组蛋白质家族，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白因具有良好的物理性能和生物学特性，在医药、组织工程、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。按照胶原蛋白发现的先后顺序，可将其分为I型、II型、III型等28种胶原蛋白。其中III型胶原蛋白血管中含量较高，主要存在于肺泡间质中且分布杂乱，因而形成复杂的网状结构，且使得肺组织具有良好的柔韧性与弹性，并且可以为细胞提供充足养分，使得皮肤饱满透亮。目前工业上制备胶原蛋白方法主要为传统提取法。即动物组织如猪皮、牛皮等的酸、碱、盐、酶处理法，此法具有操作简单、生产时间短、回收率高等优点，但得到的胶原蛋白为水不溶性胶原蛋白，可加工性弱，提取过程中会造成部分生物活性的丧失，且提取的产品中含有动物疾病等病毒隐患，应用于人体会产生异体或异种的排斥反应，限制了其在医学组织材料领域的普遍应用通过基因工程手段生产的类人胶原蛋白性能与天然胶原蛋白相近，但与天然胶原蛋白相比，类人胶原蛋白无病毒隐患、免疫排斥反应低，不仅保留了胶原蛋白原有功效，更赋予了其新的功能，如：可加工性、水溶性、质量可控性等。因此，利用分子生物学手段构建基因工程菌株对制备高质量的类人胶原蛋白具有重要意义。但是由于胶原蛋白在体内的合成和修饰复杂，正确折叠成具有生物活性的胶原蛋白除了胶原链之外，还需要含有球状的头部和尾部，因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构，导致目前III型类人胶原蛋白种类较少，价格昂贵，且抗氧化活性有待进一步提高。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种新型的III型类人胶原蛋白，以胶原蛋白特征序列Gly-X-Y为基础设计了一段III型类人胶原蛋白基因，并将构建好的表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌可成功表达分子量为13.1kD的类人胶原蛋白。本专利技术的III型类人胶原蛋白亲水性好，可随意组装形成大分子量的类人胶原蛋白，并且抗氧化活性较高。本专利技术的第一个目的是提供一种III型类人胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供所述的III型类人胶原蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三个目的是提供包含所述的编码基因的重组表达载体。进一步地，所述的重组表达载体是以pET-28a为载体。本专利技术的第四个目的是提供表达所述的III型类人胶原蛋白的重组菌。进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。本专利技术的第五个目的是提供所述的重组菌的构建方法，包括如下步骤：将包含III型类人胶原蛋白编码基因的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，培养、筛选阳性转化子，得到所述的重组菌。本专利技术的第六个目的是提供生产III型类人胶原蛋白的方法，包括如下步骤：将表达所述的III型类人胶原蛋白的重组菌以8～12％接种量接种至发酵培养基中发酵培养30～40h，离心去除菌体，得到含有类人胶原蛋白的上清液，纯化除盐得到所述的III型类人胶原蛋白。进一步地，所述的发酵培养基为蛋白胨18～22g/L，酵母粉22～25g/L，KH2PO42.0～2.5g/L，K2HPO4·3H2O16.0～16.5g/L，甘油0.3～0.5％v/v。本专利技术的第七个目的是提供所述的III型类人胶原蛋白在生物医药材料或化妆品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供一种新型的III型类人胶原蛋白，以胶原蛋白特征序列Gly-X-Y为基础设计了一段III型类人胶原蛋白基因，并将构建好的表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，重组大肠杆菌可成功表达分子量为13.1kD的类人胶原蛋白。本专利技术的III型类人胶原蛋白亲水性好，可随意组装形成大分子量的类人胶原蛋白，并且抗氧化活性较高。附图说明图1是大肠杆菌BL21(DE3)-pET-28a-kit在自制的发酵培养基中发酵生产III型类人胶原蛋白的结果；图2是纯化的III型类人胶原蛋白SDS-PAGE电泳结果。M为标准蛋白分子量，泳道1为初始发酵液细胞破碎液上清，泳道2为BL21(DE3)-pET-28a-kit制备并经纯化的III型类人胶原蛋白；图3是纯化的III型类人胶原蛋白质谱分析结果；图4是纯化的III型类人胶原蛋白圆二色谱分析结果；图5是纯化的III型类人胶原蛋白还原能力测定结果；图6是纯化的III型类人胶原蛋白清除DPPH·自由基能力测定结果；图7是纯化的III型类人胶原蛋白清除·OH自由基能力测定结果；图8是类人胶原蛋白冻干品与市售胶原蛋白水溶性验证图(浓度均为20mg/mL)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。类人胶原蛋白含量测定：采用Bradford法测定菌体总蛋白含量，使用QuantityOne软件扫描并分析SDS-PAGE电泳图，分析类人胶原蛋白占总蛋白的比例，根据菌体总蛋白量与类人胶原蛋白的百分含量计算出类人胶原蛋白含量。实施例1：重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET-28a-kit的构建(1)III型类人胶原蛋白基因扩增：以含有亲本III型类人胶原蛋白基因质粒pUC-57-kit为模板进行PCR扩增，PCR体系为：25μL(Premix)，1μLpUC-57-kit，上下游引物各1μL，22μLddH2O。扩增条件：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，8min；35个循环；72℃，15min。本文设计的III型类人胶原蛋白以人Ⅲ型胶原蛋白α1链mRNA序列(GenBank：X14420.1)为模板，以三螺旋区域的特征序列(Gly-X-Y)为基础，将脯氨酸之外的部分疏水氨基酸进行亲水性氨基酸的相似性替换，设计了一段编码分子量为13.1kD的类人胶原蛋白基因kit且此序列两端含有同尾酶序列，可以在此基础上随意获得任何分子量的类人胶原蛋白。其中重组质粒构建所用的上游引物和下游引物：上游引物：CGGGATCCAGAGGTCCACCCGGTGAGC下游引物：CGGAATTCTTAACCACCGGCTGGACCTTGG(2)用DpnⅠ酶消化模板质粒，DpnⅠ酶切消化体系：8.5μL上述PCR产物，1μL10×Tbuffer，0.5μLDpnⅠ。将DpnⅠ酶切消化体系置于37℃下，2h。(3)重组质粒转化：将上步消化产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中。涂布于LB(含100μg/mL硫酸卡那霉素)平板。挑选阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种III型类人胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种III型类人胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种权利要求1所述的III型类人胶原蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种包含权利要求2所述的编码基因的重组表达载体。


4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是以pET-28a为载体。


5.一种表达权利要求1所述的III型类人胶原蛋白的重组菌。


6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。


7.一种权利要求5或6所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将包含III型类人胶原蛋白编码基...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚劲松，史劲松，李瑛琦，许正宏，钱建瑛，蒋敏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32