催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法技术

提供了催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法，步骤为：1)将编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的Sfp基因和编码靛蓝合成酶的bpsA基因，分别克隆在含植物启动子的质粒的植物启动子下游；2)将获得的质粒，在大肠杆菌中扩增，并转入土壤农杆菌；3)把含Sfp和bpsA的DNA转入植物中；本发明专利技术生产的蓝色花，具有天然花的各种特征，新鲜有花香，不脱色，无毒。转基因编码的酶和产生的靛蓝不在液泡中，不受植物液泡低pH的影响，可形成纯正的蓝色。产生蓝色物质的前体物，即酶的底物为植物体内富含的谷氨酰胺，涉及的酶促反应仅有一步，可以从自然界中有的白花出发进行转基因改造。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法
本专利技术属于生物
，涉及一种催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法。
技术介绍
花色是观赏植物的重要的观赏特征，针对花色的改良一直是园艺工作者的重要目标之一。植物的花色不仅在植物的授粉和繁衍后代方面起到重要作用，也为人类提供了五彩斑斓的观赏感受，具有重要的美学价值(Grotewold,E.The genetics and biochemistry of floral pigments[J].Annual Review of Plant Biology,2006,57(1):761.)。作为花种重要的观赏植物，现代玫瑰(Rosa hybrida)已有5000年的栽培历史。至今，人类已培育出2500多个品种，然而这其中却没有真正的蓝色的玫瑰。市场上现有的蓝色玫瑰，如“蓝色妖姬”实际上是用染料染出的蓝色(Holton T.A,Tanaka Y.Blue roses:a pigment of our imagination？[J].Trends in Biotechnology：United Kingdom,1994,12(2):40–42.)。蓝色玫瑰(Blue rose)在英语里作为成语，表示不可能实现的奇迹，频繁出现在包括电影、电视、诗歌、小说、戏剧等各种文艺作品中。植物的花的颜色有很多决定因素，包括类黄酮类的花青素，萜类的胡萝卜素，还有液泡的pH值，金属离子等(Tanaka Y,Brugliera F.Flower colour and cytochromes P450[J].Philosophical Transactions of the Royal Society of London,2013,368(1612):283-291.)。花青素在不同位点和不同程度的羟基化使花具有不同的颜色，其中类黄酮3’5’羟基化酶(F3’5’H)催化形成蓝色的花翠素，这是很多植物开蓝花的原因。由于包括玫瑰等植物在内的很多植物缺少编码F3’5’H的基因，所以这类植物没有蓝色的花(Mikanagi Y,Saito N,Yokoi M,et al.Anthocyanins in flowers of genus Rosa,sections Cinnamomeae(＝Rosa),Chinenses,Gallicanae and some modern garden roses[J].Biochemical Systematics & Ecology,2000,28(9):887.)。日本Suntory公司利用转基因技术，通过导入包括F3’5’H在内的外源基因，同时抑制其它几个基因的表达来实现让自然界不开蓝色花的植物开出蓝色的花朵。该方法涉及多个基因的改造，所需前体物质复杂，制作成本极高，这一技术在康乃馨和菊花中取得成功，而由于玫瑰的液泡pH值很低(pH约为2.7)，这一技术在玫瑰上应用只得到淡紫色的花，无法展现真正的蓝色(图1)(Katsumoto Y,Fukuchimizutani M,Fukui Y,et al.Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin.[J].Plant & Cell Physiology,2007,48(11):1589.)。尽管如此，这种淡紫色的玫瑰，每朵售价22-35美元(Staff(20 October 2009)."Blue roses to debut in Japan".The Independent,House and Home.Retrieved 30 August 2012.)，为Suntory公司带来巨大经济效益，目前这种玫瑰只在日本和美洲大陆供应。真正蓝色的玫瑰的获得依然是一个人类还没有能解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法。本专利技术的技术方案概述如下：催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法，包括如下步骤：1)选取编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的Sfp基因和编码靛蓝合成酶的bpsA基因，分别克隆在含植物启动子的质粒的植物启动子下游；2)将步骤1)获得的质粒，在大肠杆菌中扩增，并转入土壤农杆菌；3)利用土壤农杆菌介导把含Sfp和bpsA的DNA转入植物中；4)在花瓣细胞内功能性表达Sfp和BpsA蛋白，利用谷氨酰胺合成靛蓝使花瓣变蓝；所述Sfp基因为任何物种来源的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因，或编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶同功酶的基因；所述bpsA基因为任何物种来源的编码靛蓝合成酶的基因，或编码靛蓝合成酶同功酶的基因；所述植物启动子为在植物细胞中能驱动下游基因表达的DNA序列。优选地，Sfp基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。优选地，Sfp基因所编码的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。优选地，bpsA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。优选地，bpsA基因所编码的靛蓝合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。优选地，Sfp基因上游的植物启动子CHSp的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。优选地，bpsA基因上游的植物启动子RhAGp的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。含植物启动子的质粒优选：pBI121。所述花卉为玫瑰、月季、百合、菊花、康乃馨或兰花。一种获得蓝色花卉的转基因方法，使花卉的花瓣含有化合物靛蓝，所述花卉为玫瑰、月季、百合、菊花、康乃馨或兰花。本专利技术的优点：本专利技术克服了现有技术如染料染色、以及转基因方法的不足，染料对花进行染色具有更明显的人工痕迹，容易脱色，使用的有机染料通常还有毒；花通常为干花，不具花的香味，如果是鲜花染色则不宜保存，很快凋敝。本专利技术的方法生产的蓝色花，具有天然花的各种特征：新鲜，有花香，不脱色，无毒。本专利技术所用方法转基因编码的酶不在液泡中，产生的靛蓝也不在液泡中，不受植物液泡低pH的影响，因而可以形成纯正的蓝色(royal blue)。产生蓝色物质的前体物，即酶的底物为植物体内富含的简单氨基酸，谷氨酰胺，涉及的酶促反应仅有一步，不需要复杂的前体物质，可以从自然界中有的白花出发进行基因改造。用转基因的方法培育出蓝色的花卉，如百合、月季、菊花、康乃馨、兰花等，特别是蓝色的玫瑰的获得。附图说明图1日本Suntory公司蓝色玫瑰改造策略。其中，图1-1为Suntory公司利用花翠素的生物合成获得淡紫色玫瑰花的基因改造路线图；图1-2为Suntory最终获得的淡紫色玫瑰花照片。图2磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp与靛蓝合成酶bpsA的信息图。包括，磷酸泛酰巯基本文档来自技高网...

【技术保护点】
催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法，其特征包括如下步骤：/n1)选取编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的Sfp基因和编码靛蓝合成酶的bpsA基因，分别克隆在含植物启动子的质粒的植物启动子下游；/n2)将步骤1)获得的质粒，在大肠杆菌中扩增，并转入土壤农杆菌；/n3)利用土壤农杆菌介导把含Sfp和bpsA的DNA转入植物中；/n4)在花瓣细胞内功能性表达Sfp和BpsA蛋白，利用谷氨酰胺合成靛蓝使花瓣变蓝；/n所述Sfp基因为任何物种来源的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因，或编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶同功酶的基因；/n所述bpsA基因为任何物种来源的编码靛蓝合成酶的基因，或编码靛蓝合成酶同功酶的基因。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180131 CN 2018100958292催化谷氨酰胺合成靛蓝获得蓝色花卉的转基因方法，其特征包括如下步骤：
1)选取编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的Sfp基因和编码靛蓝合成酶的bpsA基因，分别克隆在含植物启动子的质粒的植物启动子下游；
2)将步骤1)获得的质粒，在大肠杆菌中扩增，并转入土壤农杆菌；
3)利用土壤农杆菌介导把含Sfp和bpsA的DNA转入植物中；
4)在花瓣细胞内功能性表达Sfp和BpsA蛋白，利用谷氨酰胺合成靛蓝使花瓣变蓝；
所述Sfp基因为任何物种来源的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因，或编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶同功酶的基因；
所述bpsA基因为任何物种来源的编码靛蓝合成酶的基因，或编码靛蓝合成酶同功酶的基因。


根据权利要求1所述的方法，其特征是所述Sfp基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。


根据权利要求2所述的方法，其特征是所述Sfp基因所编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雁，陈义华，南迦纳杰·阿瑟·安卡拉哈里，胡逸灵，李鹏伟，
申请(专利权)人：天津大学，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12