菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法技术

本发明专利技术提供了一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法，包括组培苗培养，转基因侵染菌液的制备，侵染与共培养，毛状根的诱导，毛状根的除菌培养，毛状根的液体扩大培养。本发明专利技术提供了针对菊叶薯蓣转基因毛状根的诱导方法，以菊叶薯蓣去根组培苗作为外植体，发根农杆菌C58C1作为诱导菌株，在特定浓度的乙酰丁香酮条件下可高效诱导产毛状根，诱导率可达50％～85％，同时本发明专利技术可根据需求诱导产生含不同目的基因的转基因毛状根。本发明专利技术对菊叶薯蓣功能基因的鉴定、薯蓣皂苷合成等生物代谢途径的研究、分子育种、次生代谢物产业化生产等具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法
本专利技术涉及植物基因工程
，更具体地，涉及一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法。
技术介绍
菊叶薯蓣(DioscoreacompositaHemsl.)为薯蓣科多年生缠绕型草本植物，原产于墨西哥，是墨西哥生产激素类药物原料薯蓣皂苷元的主要栽培品种之一。我国于1978年首次在西双版纳热带植物园引种成功，其特点是薯蓣块茎产量高，薯蓣皂苷元和淀粉含量也高，是生产薯蓣皂素和发酵生产燃料乙醇的优选原材料。但由于野生薯蓣资源被过度开采，其再生速度跟不上市场的需求，薯蓣皂苷元的产量也远无法满足甾体药物工业的生产需求，供求矛盾越发突出。因此，通过优选良好的薯蓣资源，并加以研究如何提高其根状或块茎的产量和薯蓣皂苷元的含量，掌握薯蓣皂苷元在植物体内的消长规律，以稳定其含量等潜在着巨大的经济效益。发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)是根瘤菌科农杆菌属的一种侵染性很强的革兰氏阴性土壤杆菌，能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及裸子植物，在植物基因工程领域具有广泛的应用。发根农杆菌携带的Ri质粒是位于发根农杆菌染色体之外独立的双链环状DNA，包括Vir区和T-DNA区。发根农杆菌侵染植物时，植物受创伤后在伤口处产生小分子酚类化合物，从而诱导活化Ri质粒上的Vir区基因群，调控T-DNA区，将诱导发根的基因位点rol基因(rolB、rolC等)转移到植物宿主细胞基因中，从而引起植物形态和代谢改变，导致毛状根产生。发根农杆菌诱导植物所产生的毛状根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定以及分化程度高、不易变异等特点，常用来作为很多重要研究的模型。薯蓣属植物属于单子叶植物，而单子叶植物不合成酚类物质，如乙酰丁香酮，很难诱导出毛状根。根据毛状根诱导的相关研究报道，关于单子叶植物成功诱导毛状根的相关研究报道很少，而关于薯蓣属植物毛状根诱导的相关研究报道，目前也仅见于盾叶薯蓣的毛状根诱导有初步研究(陈永勤,沈君豪,潘军.盾叶薯蓣毛状根的诱导与薯蓣皂甙元的生产[J].湖北大学学报(自然科学版),2009(01):79-83.)，其应用R1601、A4等发根农杆菌，以盾叶薯蓣的茎段、叶片和愈伤组织为外植体进行了毛状根诱导，发现只有愈伤组织能够被诱导产生毛状根，而且诱导效率较低，为34.5％，而有关于菊叶薯蓣毛状根诱导的相关技术目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法，包括如下步骤：S1.组培苗培养将生根的菊叶薯蓣组培苗去掉根后转接到继代培养基上预培养10～20天，获得外植体；S2.转基因工程菌的准备将活化后的发根农杆菌C58C1经扩大培养后制备感受态细胞，然后转入含目的基因的表达载体，再筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌C58C1工程菌；S3.转基因侵染菌液的制备将步骤S2的转基因发根农杆菌C58C1工程菌经进行扩大培养，OD600在0.5～0.6时，离心收集菌种，然后用含有乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基重悬菌体，至OD600在0.5～0.6，得到侵染菌液；S4.侵染与共培养将步骤S1的外植体于步骤S3的侵染菌液中侵染15～30min，侵染完毕后，移出外植体并去除外植体表面的液体，然后将外植体转接至含有乙酰丁香酮的MS固体培养基，于23～27℃黑暗共培养2～3天；S5.毛状根的诱导将外植体从共培养的培养基中取出，置于含有头孢噻肟钠抗生素无菌水中浸泡8～10分钟，然后用纯无菌水清洗2～4遍；待清洗完毕后将去除外植体表面的水分，然后将外植体转接至含有头孢噻肟钠的MS固体培养基中培养；S6.毛状根的除菌培养待外植体发根后12～16天，去掉外植体的茎、叶，将留下的毛状根转接到新的含头孢噻肟钠的MS固体培养基中，每两周转接一次，并且不断降低头孢噻肟钠的工作浓度直到为零；S7.毛状根的液体扩大培养将除菌培养后的毛状根从外植体分离成一条一条，然后接种到1/2MS液体培养基震荡培养。优选地，还包括转基因毛状根PCR检测步骤：提取毛状根DNA，然后进行PCR鉴定，鉴定基因包括rolB、rolC以及转入的目的基因。优选地，所述继代培养基为MS+0.05～0.3mg/LNAA+1.2～1.7mg/L6-BA。进一步优选地，所述继代培养基为MS+0.1mg/LNAA+1.5mg/L6-BA。优选地，步骤S1预培养为23～27℃，光照强度1500～2500lx，每天光照时间14～18h，培养10～20天。进一步优选地，步骤S1预培养为25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h，培养约两周。优选地，步骤S2为活化发根农杆菌C58C1并制作感受态细胞，然后将含有目的基因的表达载体转化到该菌种的感受态细胞，复苏菌种，离心富集菌体，并涂布于含有利福平抗生素的YEB固体培养基上，待长出单菌落后，挑去单菌落培养，并进行PCR鉴定和酶切鉴定，阳性转基因工程菌C58C1。进一步优选地，含目的基因的表达载体转化到发根农杆菌使用的是冻融法；菌种复苏条件为28℃，180r/min震荡培养3h；所使用的利福平抗生素的工作浓度为50mg/L。优选地，步骤S4所述侵染为26～30℃，130～160r/min震荡侵染15～30min。进一步优选地，步骤S4所述侵染为28℃，150r/min震荡侵染20min。优选地，步骤S3含有乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基及步骤S4中含有乙酰丁香酮的MS固体培养基中乙酰丁香酮浓度为100～600μmol/L。进一步优选地，所述乙酰丁香酮浓度为400～600μmol/L。优选地，步骤S5所述含有头孢噻肟钠抗生素无菌水和含有头孢噻肟钠的MS固体培养中头孢噻肟钠浓度为200～300mg/L。进一步优选地，所述头孢噻肟钠浓度为250mg/L。优选地，步骤S5所述培养为于23～27℃，光照强度1500～2500lx，每天光照时间14～18h，培养3～5天。进一步优选地，步骤S5所述培养为于温度25℃，光照强度2000lx，每天光照时间16h，培养3～5天。优选地，步骤S6第一次转接的MS培养基中头孢噻肟钠的工作浓度为250mg/L，第二次转接的头孢噻肟钠工作浓度为100mg/L，最后将材料转接到不含Cef的MS固体培养基中。优选地，所述目的基因为GFP。但不仅限于基因，可根据不同的研究需求，构建含有不同目的基因的表达载体，转入发根农杆菌C58C1感受态中制备转基因工程菌，再诱导表达目的基因的转基因毛状根。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了针对菊叶薯蓣转基因毛状根的诱导方法，以菊叶薯蓣去根组培苗作为外植体，发根农杆菌C58C1作为诱导菌株，在特定浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.组培苗培养/n将生根的菊叶薯蓣组培苗去掉根后转接到继代培养基上预培养10～20天，获得外植体；/nS2.转基因工程菌的准备/n将活化后的发根农杆菌C58C1经扩大培养后制备感受态细胞，然后转入含目的基因的表达载体，再筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌C58C1工程菌；/nS3.转基因侵染菌液的制备/n将步骤S2的转基因发根农杆菌C58C1工程菌经进行扩大培养，OD

【技术特征摘要】
1.一种菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.组培苗培养
将生根的菊叶薯蓣组培苗去掉根后转接到继代培养基上预培养10～20天，获得外植体；
S2.转基因工程菌的准备
将活化后的发根农杆菌C58C1经扩大培养后制备感受态细胞，然后转入含目的基因的表达载体，再筛选、鉴定，得到转基因发根农杆菌C58C1工程菌；
S3.转基因侵染菌液的制备
将步骤S2的转基因发根农杆菌C58C1工程菌经进行扩大培养，OD600在0.5～0.6时，离心收集菌种，然后用含有乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基重悬菌体，至OD600在0.5～0.6，得到侵染菌液；
S4.侵染与共培养
将步骤S1的外植体于步骤S3的侵染菌液中侵染15～30min，侵染完毕后，移出外植体并去除外植体表面的液体，然后将外植体转接至含有乙酰丁香酮的MS固体培养基，于23～27℃黑暗共培养2～3天；
S5.毛状根的诱导
将外植体从共培养的培养基中取出，置于含有头孢噻肟钠抗生素无菌水中浸泡8～10分钟，然后用纯无菌水清洗2～4遍；待清洗完毕后将去除外植体表面的水分，然后将外植体转接至含有头孢噻肟钠的MS固体培养基中培养；
S6.毛状根的除菌培养
待外植体发根后12～16天，去掉外植体的茎、叶，将留下的毛状根转接到新的含头孢噻肟钠的MS固体培养基中，每两周转接一次，并且不断降低头孢噻肟钠的工作浓度直到为零；
S7.毛状根的液体扩大培养
将除菌培养后的毛状根从外植体分离成一条一条，然后接种到1/2MS液体培养基震荡培养。


2.根据权利要求1所述的菊叶薯蓣转基因毛状根诱导方法，其特征在于，还还包括转基因毛状根PCR检测：提取毛状根DNA，然后进行PCR鉴定，鉴定基因包括rolB、rolC以...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢君，周建婵，钟春梅，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44