由二维电泳将样品分离成组分的方法使用在空间上分隔并在一个通常为平面的单独支撑装置上处理的ＩＰＧ条和凝胶板。首先将平面支撑机构定位在通常垂直的平面，将第一电泳分离介质定位在第二电泳分离介质上方或下方并相隔一定间隙的水平面上。然后对条中的样品混合物进行第一维分离，此时条和板由基本与水互不溶合并且不能萃取出水的不导电液体分离。在进行第一分离之后倾斜支撑机构，使得第一条和水平面形成一角度，从条和板之间的间隙冲洗出石蜡。然后将包含缓冲剂的琼脂糖胶流入间隙，以在电场的影响下允许样品分子从条转移到板。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及将第一和第二维凝胶包含在单一盒中进行二维电泳的方法。为达到2-D凝胶的真实高产量和再现性，必须尽可能地排除操作者的干扰。这可以通过在单一盒中结合第一和第二维凝胶来实现，因此不需要操作者人工干扰凝胶。这一人工干扰步骤既缓慢又麻烦，并且将形成操作者之间的差异，从而导致缺乏再现性。在单一盒中结合两种凝胶的另一个优点是将运行硬件减少为一个单一设备，因此增加了自动化的可能性。在单一盒中将凝胶放置在一起要求能将凝胶放置在彼此相隔的几微米内，同时直到要求蛋白质从第一向第二维转移时保持凝胶之间的分离。将第一和第二维凝胶结合在单一盒中具有很大的技术难度。首先，由于存在溶液，因此在两种凝胶中的离子条件相当不同。第一维等电子聚焦凝胶具有非常低的离子强度，不与高电平的盐或缓冲剂相容。等电子聚焦是在高达10,000伏的高电压和典型地每个凝胶小于1mA的非常低的电流下进行的。与此相反，第二维凝胶具有通常为100-500mM范围的高缓冲剂盐浓度，电泳是在每个凝胶5-100mA的高电流下进行的。因此，当将这两种凝胶紧密放置时必须仔细，以保证来自第二维凝胶的缓冲剂不污染第一维凝胶，这种污染会导致非常高的电流和第一维凝胶的随后燃烧。人们面对的第二个问题是如何将样品加载到第一维凝胶上而不允许任何样品过早地转移到第二维凝胶中。进行等电子聚焦的最好方式是使用固定pH梯度(IPG)，该梯度典型地作为干燥条提供并且和样品溶液再水合，从而将样品分布在整个凝胶上，这样允许高蛋白质的负荷。当在单一盒中结合两种凝胶时，难以用样品润湿IPG的整个表面而不允许一些样品转移到第二维凝胶中。为了提供用于进行二维电泳的结合的条凝胶和板凝胶，人们已经进行了很多尝试。US 4874490公开了这样的一种设备。然而其中提出的方法不易操作，而且不实用，并且没有给出正在执行和实际工作的方法的例子。随着人们对蛋白质领域越来越感兴趣，必须进行比以前更多的分离。分离，特别是二维分离，需要大量的劳动力，在这个领域中增加工人生产率的唯一可行方式是提供易于自动化的方法和系统。美国专利No.4874490中所示方法如果能在任何情况下工作，那么将会很困难，如果不能在任何情况下工作，那么将很难形成机械化。美国专利No.5773645公开了在普通载体上进行二维分离的另外一种设备。这份说明书依然没有公开使用这种设备的任何一个示例或结果。所公开的这种系统要形成自动化依然很困难，并且会很昂贵。本专利技术的一个目的是提供一种新方法，该方法以允许方法和系统自动化的方式克服了与在单一盒中结合和运行第一和第二维凝胶相关的技术难题。已经包括在本说明书中的文献、行为、材料、设备、制品等的任何讨论仅用于提供本专利技术的环境。尽管在本申请每个权利要求的优先权日期之前它们在澳大利亚已经存在，但是我们并不认为这些内容形成了现有技术基础，或者是和本专利技术相关的领域内的公知常识。
技术实现思路
在第一主要方面，本专利技术的基本思想是提出允许第一维等电子聚焦凝胶和第二维电泳凝胶在单一盒中结合、贮存、运输和运行的新方法，该方法易于自动化。在第二方面，本专利技术提供采用样品蛋白质或多肽的溶液再水合第一维凝胶的方法。所述再水合在盒中进行，而样品溶液没有向第二维凝胶转移。在第三方面，本专利技术提供在进行等电子聚焦时在第一和第二维凝胶之间放置电流绝缘屏蔽物的方法。屏蔽物防止两种凝胶在盒中的脱水，另外防止样品从第一维凝胶向第二维凝胶的任何过早转移或缓冲剂盐从第二维凝胶向第一维凝胶的转移。本专利技术的另一方面是除去电流绝缘屏蔽物和提供优选一个凝胶的缓冲剂浸渍的导电桥接材料，以连接第一维凝胶与第二维凝胶的方法。桥接材料允许蛋白质从第一维凝胶转移到第二维凝胶。本专利技术的又一个方面是提供电连接到第一维凝胶末端以允许进行电泳的装置。在一个具体方面，提供一种由二维电泳将样品分离成组分的方法，该方法包括a.提供包括典型地是IPG条的伸长条的第一电泳分离介质，和典型地为板的形式的第二电泳分离介质，该介质被隔离并在单一的通常为平面支撑的机构上处理；b.平面支撑机构定向在通常垂直的平面中，第一电泳分离介质定向在从上方或下方和第二电泳分离介质间隔一个间隙的水平平面中，在第一电泳分离介质中进行样品混合物的第一维分离，同时第一和第二介质由不导电液体分离，不导电液体具有低粘度和低挥发性，基本不可燃，基本与水不互溶，并且不能萃取出水；c.在进行第一分离之后倾斜支撑机构，使得第一电泳分离介质和水平面形成一角度，并在第一电泳分离介质和第二电泳分离介质之间的间隙中冲洗出液体；和d.使包含桥接材料的液体缓冲剂，典型地是包含缓冲剂的琼脂糖胶，流入间隙，以在电场的影响下允许样品分子从第一电泳分离介质转移到第二电泳分离介质。在此使用的术语“不能萃取出水”覆盖了完全不与水互溶和因此并不吸收或吸附任何水的液体。有许多溶剂通常描述为不与水互溶，但事实上在变饱和及形成两层之前它们可吸收一定数量的水。这样的溶剂一般不适用于本专利技术，这是由于它们在尚未水饱和之前将从凝胶或IPG条抽出水和因此脱水成凝胶或IPG条，而如果它们饱和了，将在IPG条上进行第一维分离的12-48小时的相对长时间内不能充分电绝缘。第一电泳分离介质较佳地至少部分由可除去的覆盖物包围，这样允许支撑机构为垂直方向时，典型地使用包含要分离样品的液体使介质再水合。可除去的覆盖物最优选由金属箔等制成。IPG条的存放期取决于它们保持的条件。如果保持完全干燥，IPG条可保存很多年。然而，空气可引起条的氧化，大气中存在的水蒸汽也会增加条的降解速率，因此优选是气密性密封。2D凝胶板的存放期典型地是一年，因此IPG上的密封需要在至少如此长的时间内保持IPG条处于良好状态。由于它们气密性不如金属箔并且不可能保持IPG到要求的一年时间，因此塑料膜相反并不能提供良好的密封。与其中支撑机构可以水平或水平和垂直定向的现有技术比较，支撑机构同样垂直定向时可以进行全部的二维电泳分离，因此系统可以实现机械化。非传导性液体最优选是石蜡油，它和水互不溶合，不能萃取出水，具有较高的疏水性和相对低的粘度。由于它允许石蜡油填充在IPS条和凝胶板之间相对窄(典型地为1-4mm)和回旋的间隙内，低粘度是有利的。根据间隙尺寸，优选是粘度至多为30mm2/S的油，典型地使用10-25mm2/S。由于用于桥接间隙的琼脂糖具有比IPG条和2d凝胶板两者大的孔径大小，这会是不利的。因此扩散倾向于在琼脂糖胶中发生，由于运行时间更短和发生较小的扩散，间隙越窄越好。附图说明图14A是组装盒子另外结构的前正视图；和图15A-15E是盒子另外结构的横向截面图。IPG 12在第二维凝胶顶面上距离该顶面大约2mm的间隙16，并和第二维凝胶的顶表面充分平行。在IPG 12的末端和盒子10的侧面之间保持大约5mm的间隙18，以允许用于第二分离的电极桥材料插入。尽管图中显示的装置使单个IPG 12平行于第二维凝胶的顶部，并距离第二维凝胶大约2mm，本领域技术人员很清楚地知道，这种设计的结合2-D凝胶可以以线性阵列包含一个或多个IPG，这些IPG与第二维凝胶顶部的间隔可以大于或小于2mm。如图3所示，在较佳实施例中，IPG固定到盒子的单一板20上。同样如图3所示，干燥IPG由薄金属箔覆盖片22覆盖，该覆盖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过二维电泳将样品分离成组分的方法，该方法包括：ａ．提供包括伸长条的第一电泳分离介质以及第二电泳分离介质，所述介质被隔离并在单一支撑机构上处理；ｂ．将平面支撑机构定位在通常垂直的平面，第一电泳分离介质定位在位于第二电泳分离介质上 方或下方并相隔一定间隙的水平平面，在第一电泳分离介质中进行样品混合物的第一维分离，此时第一和第二介质由和水充分互不相溶并且不能萃取出水的不导电液体分离；ｃ．在进行第一分离之后倾斜支撑机构，使第一电泳分离介质和水平面形成一角度，并从第一电 泳分离介质和第二电泳分离介质之间的间隙冲洗出液体；和ｄ．将包含桥接材料的液体缓冲剂流入间隙，以在电场的影响下允许样品分子从第一电泳分离介质转移到第二电泳分离介质。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：本赫伯特，
申请(专利权)人：普罗托姆系统有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。