葡萄糖脱氢酶制造技术

概述了以两个亚基通过二硫键相互连接为特征的水溶性ＰＱＱＧＤＨ。本发明专利技术的水溶性ＰＱＱＧＤＨ的特征是具有改进的热稳定性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及到以吡咯并喹啉醌作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的制造、以及在葡萄糖的定量中该酶的使用。
技术介绍
血中葡萄糖浓度是糖尿病的重要标志。另外在利用微生物的发酵生产中，为了对发酵过程进行监测也要对葡萄糖浓度进行定量。以往，是通过使用葡萄糖氧化酶(GOD)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的酶法对葡萄糖进行定量。然而，要使用GOD方法，为了对伴随葡萄糖氧化反应而产生的过氧化氢进行定量需要向分析体系中添加过氧化氢酶或过氧化物酶。G6PDH虽然可以用于基于分光光度法的葡萄糖定量，但必须要向反应体系中添加作为辅酶的NAD(P)。所以，人们尝试使用新的酶PQQGDH代替到目前为止的葡萄糖酶定量方法中一直使用的GOD或G6PDH(特开平10-243786、WO00/66744、WO 00/61730)。PQQGDH由于对葡萄糖具有很高的氧化活性，以及由于PQQGDH是辅酶结合型的酶，可以不需要氧作为电子受体，所以作为葡萄糖传感器的识别元件很有用。PQQGDH催化葡萄糖氧化，生成葡糖酸内酯的反应。PQQGDH中存在着膜结合性酶和水溶性酶。膜结合性PQQGDH是分子量约为87kDa的信号肽蛋白质，广泛分布于各种革兰氏阴性菌中。水溶性PQQGDH被确认存在于乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的几种菌株中(Biosci.Biotech.Biochem.(1995)，59(8)，1548-1555)，其结构基因已被克隆，氨基酸序列被阐明(Mol.Gen.Genet.(1989)，217430-436)。来自乙酸钙不动杆菌的水溶性PQQGDH是由同一50kDa亚基构成的均二聚体酶。各个亚基含有1分子的PQQ和3个Ca++。二聚体蛋白质具有2个活性中心，但单体酶不表现出GDH活性。因此为了表现出GDH活性，形成二聚体结构是必需的。另外，对水溶性PQQGDH进行了X线晶体结构解析，该酶的高级结构已被阐明(J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)，A.Oubrie etal.，EMBO Journal，18(19)5187-5194(1999)，A.Oubrie etal.，PNAS，96(21)，11787-11791(1999)，A.Oubrie etal.)。本专利技术的目的在于提供具有热稳定性改善的改变型水溶性PQQGDH。
技术实现思路
本专利技术提供水溶性PQQGDH，其特征是两个亚基是通过1个或1个以上的二硫键相互连接的。本说明书中所谓「PQQGDH」指的是以吡咯并喹啉醌作为辅酶的葡萄糖脱氢酶。而所谓「改变型PQQGDH」指的是天然存在的葡萄糖脱氢酶结构的一部分经化学手段改变后的PQQGDH。这样的改变可以通过例如将酶蛋白中的1个或1个以上氨基酸残基用其他天然存在的或天然不存在的氨基酸残基置换，或者是通过缺失或附加1个或1个以上氨基酸来进行。而在本说明书中PQQGDH的氨基酸位置是以起始的蛋氨酸作为第1位编号的。因此序列1所示的起始氨基酸残基Asp是第25位氨基酸残基。在本说明书中，所谓「二硫键」指的是-S-S-键。而「亚基」指的是构成二聚体的各单体亚基。优选的本专利技术水溶性PQQGDH是天然存在的PQQGDH中的1个或1个以上的氨基酸残基(半胱氨酸除外)被半胱氨酸残基置换后的PQQGDH。另外优选的本专利技术水溶性PQQGDH来自于乙酸钙不动杆菌。在本专利技术的PQQGDH的特别优选状态中，序列1所示氨基酸序列中的415位丝氨酸残基被半胱氨酸置换，在分别位于2个亚基上的半胱氨酸残基之间形成二硫键。在另一个优选状态中，序列1所示氨基酸序列中的414位酪氨酸残基被半胱氨酸残基置换，在分别位于2个亚基上的半胱氨酸残基之间形成二硫键。在另一个优选状态中，序列1表示的氨基酸序列中的340位天冬氨酸残基以及418位酪氨酸残基都被半胱氨酸残基置换，在分别位于2个亚基上的半胱氨酸残基之间形成二硫键。在本专利技术的PQQGDH的特别优选状态中，本专利技术的PQQGDH含有序列Pro Thr Tyr Cys Thr Thr Tyr。在另一个优选状态中，本专利技术的PQQGDH含有序列Pro Thr CysCys Thr Thr Tyr。在另一个优选状态中，本专利技术的PQQGDH含有序列Thr Gly LysAsn Phe Val Pro和Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala。本专利技术提供编码本专利技术的PQQGDH的基因，含有该基因的载体和含有改基因的转化体，以及含有本专利技术PQQGDH的葡萄糖分析试剂盒和葡萄糖传感器。本专利技术的改变型PQQGDH的酶蛋白质由于具有很高热稳定性，而且对葡萄糖具有很高的氧化活性，所以可以应用于葡萄糖的高灵敏度而且高选择性的测定中。特别是由于利用在酶的生产中制备/纯化时失活少、收率高，在溶液中稳定性高、酶的保存容易的该酶在制作分析试剂盒或酶传感器的过程中失活少，使用该酶做成的分析试剂盒或酶传感器的热稳定性高，所以预期具有利于保存的优点。附图的简单说明附图说明图1表示本专利技术中使用的质粒pGB2的结构。图2表示制作编码本专利技术的改变型酶的结构基因的方法。图3表示本专利技术的改变型酶的热稳定性。图4表示本专利技术的改变型酶的热稳定性。图5表示使用本专利技术的改变型PQQGDH分析葡萄糖。图6表示本专利技术的改变型酶的热稳定性。图7表示本专利技术的改变型酶的热稳定性。具体实施例方式改变型PQQGDH的结构本专利技术的PQQGDH的特征是在均一二聚体中2个亚基是通过1个或1个以上的二硫键连接的，由此表现出很高的热稳定性。这样的连接结构可以通过将位于二聚体结构的各个单体界面上相互靠近的位置上的1个或1个以上氨基酸残基置换成半胱氨酸残基，在亚基之间形成二硫键来构建。水溶性PQQGDH具有序列1所示的氨基酸序列，根据其X射线晶体结构解析，其高级结构已被阐明(J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)，EMBO Journal，18(19)5187-5194(1999))。如果根据这样推定的高级结构构建二聚体酶时，两个单体上的Ser415位于单体界面上相互靠近的位置。将Ser415置换成Cys后，使单体间形成二硫键，结果与野生型相比可以得到具有非常高热稳定性的改变型酶。我们认为高热稳定性是由于通过二硫键的形成，水溶性PQQGDH二聚体的四级结构的稳定性增大的缘故。这与到目前为止通过利用交联化学修饰(特开2000-262281)或构建粘连结构(tetherstructure)(特开2001-37483)使二聚体结构稳定，从而使PQQGDH的热稳定性增大的见解也一致。另外在本专利技术中，通过将PQQGDH-B的二聚体界面上处于面对面位置，而且他们的侧链间距离短的Asn340和Tyr418两个残基都置换成Cys之后，在单体之间形成2个二硫键，可以得到与野生型相比热稳定性非常高的改变型酶。本领域技术人员根据本专利技术的教导以及有关酶的推测高级结构的信息，对处于二聚体结构中各个单体界面上位置相互靠近的氨基酸残基进行预测，通过将该残基用半胱氨酸置换，可以得到热稳定性提高的改变型葡萄糖脱氢酶。要置换的氨基酸残基即使不处于各个单体的同一位置也可以。就是说，在各个单体的界面中，一个单体的第1位氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
水溶性ＰＱＱＧＤＨ，其特征是：两个亚基相互之间是通过１个或１个以上的二硫键连接的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：早出广司，五十岚聪，
申请(专利权)人：究极酵素国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]