一种抗真菌剂筛选试剂盒制造技术

技术编号:2591515 阅读:259 留言:1更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及医药技术领域,是一种可用于筛选抗真菌剂,并可研究抗真菌机制及对人体毒性的试剂盒,其组成包括药敏板一块和试剂,根据本试剂盒检测结果,由该受试物是否具有抗真菌作用,能否与麦角甾醇和胆固醇结合以及结合的状况,来判断该受试物能否作为抗真菌剂,及抗真菌的作用机制和是否对人体有毒性。本试剂盒成本低廉,操作简便,可快捷有效筛选抗真菌剂,并可同时研究作用机制及对人体的毒性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药
,是一种可用于筛选抗真菌剂的试剂盒,并可研究抗真菌机制及对人体毒性。
技术介绍
在过去的近100年中,抗真菌药物研究取得了骄人成绩,但临床抗真菌药的选择范围仍很窄,种类很少,因此寻找新的抗真菌剂,研究抗真菌作用机制就成为当务之急。麦角甾醇是真菌细胞膜上含有的一种特殊生物成分,对于维持真菌细胞膜稳定性和流动性发挥重要作用,现有的抗真菌剂多针对麦角甾醇的生物合成通路,从而影响了麦角甾醇的生物合成,发挥抗真菌作用。其中多烯类抗真菌药物主要通过与真菌细胞膜麦角甾醇的直接结合,使真菌细胞膜形成空洞,内容物外泄而死亡;人体细胞的细胞膜虽不含麦角甾醇,但含有大量胆固醇,某些抗真菌剂也能与胆固醇直接结合,如多烯类药物与胆固醇可直接结合,所以当用多烯类药物抗真菌感染同时,对人体细胞也可能产生毒性,只是毒性大小不同而已。由于这种特殊的作用机制,多烯类药物抗真菌作用强,不易产生耐药性,在临床占有重要地位,是抗真菌药物的“金标准”,因此筛选类似作用机制的抗真菌药物成为一个重要研究方向。抗真菌剂筛选的常规方法有微量液基稀释法、试管法、纸片法等,是通过真菌在含药培养基中的生长情况进行判断,但只能对抗真菌作用进行初步筛选,对于其作用机制及对人体是否有毒性等重要内容难以确定,还需大量的其他实验加以证实。为此建立一种方法,筛选直接结合麦角甾醇的抗真菌剂,同时确定其对人体的毒性就非常重要。
技术实现思路
本专利技术根据真菌细胞膜含麦角甾醇而不含胆固醇,人体细胞含胆固醇而不含麦角甾醇的差异,提供一种快速有效筛选抗真菌化合物的试剂盒,根据本试剂盒的检测结果,来判断该受试物有无抗真菌作用,是否通过与麦角甾醇直接结合产生抗真菌作用,以及会不会与胆固醇结合造成对人体的毒性,从而决定取舍。本专利技术试剂盒由盒体及装在盒体内的药敏板和试剂A、B、C、D、E、F各一管组成1.药敏板多孔板一块,经钴60照射灭菌;2.试剂A1摩尔/升NaOH溶液5ml;3.试剂B蛋白胨10克,葡萄糖40克,琼脂18克(临用时加三蒸水900毫升溶解,用试剂A调整pH至7.0,定容至1000毫升,高压灭菌后制成斜面,4℃保存);4.试剂C酵母浸膏10克,蛋白胨20克,葡萄糖20克(临用时加三蒸水900毫升溶解,定容至1000毫升,高压灭菌后4℃保存);5.试剂DRPMI 1640 8.0克,碳酸氢钠2.0克,吗啡啉丙磺酸34.5克;6.试剂E含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml(临用时,加入上述试剂D溶液1000毫升,滤过消毒,4℃保存);7.试剂F含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml(临用时,加入上述试剂D溶液1000毫升,滤过消毒,4℃保存)。RPMI 1640为美国Gibco公司产品,麦角甾醇、胆固醇为美国Sigma公司产品,其余试剂为国产分析纯。本专利技术试剂盒使用方法如下1.制备受试物溶液受试物用二甲基亚砜(DMSO)配成所需浓度,倍比稀释为5~20个浓度梯度的溶液,4℃保存备用。2.将试剂盒中各管试剂配制成如上括号内相应的斜面和溶液。3.活化真菌用接种圈从真菌保存管中挑取少量真菌,划线接种于试剂B斜面上,35℃培养24小时~48小时。再用接种圈从试剂B斜面上的菌落挑取真菌少量,接种至1毫升试剂C中,于37℃、250转/分钟振荡培养,活化16小时,使真菌处于指数生长后期。4.制备真菌菌液将上述活化真菌,用血细胞计数板计数,分别以试剂D调整菌液浓度至(1~5)×105个/毫升,制成试剂D菌液;用试剂E稀释为(1~5)×105个/毫升浓度的菌液,配成含麦角甾醇的试剂E菌液;用试剂F稀释为(1~5)×105个/毫升浓度的菌液,配成含胆固醇的试剂F菌液。5.测定最低抑菌浓度值(MIC80值)取无菌药敏板,1号孔作空白对照,加1微升DMSO及99微升试剂D;第2~11号孔加入倍比稀释的受试物溶液1微升及99微升试剂D菌液;第12号孔不含受试物,加1微升DMSO及99微升试剂D菌液作阳性对照;试剂E菌液和试剂F菌液按上述试剂D菌液同法操作,放在同一块灭菌药敏板上,各平行操作2次。将该药敏板于25~37℃培养12~168小时后,用酶标分析仪于620纳米测各孔光密度值,各与相应的阳性对照孔比,以光密度值下降80%以上的最低浓度孔中的受试物浓度为MIC80,(真菌生长80%被抑制的受试物浓度)。以试剂D测得的MIC80值作为参考值,试剂E、试剂F测得的MIC80值与参考值进行比较,对结果进行判断1.试剂D测得的参考值≥64mg·L-1,表明受试物没有抗真菌作用,不用比较试剂E、试剂F测得的的结果;2.试剂D测得的参考值<64mg·L-1,试剂E结果>参考值,试剂F结果>参考值,表明受试物有抗真菌作用,并说明其与麦角甾醇直接结合发挥抗真菌作用,该受试物可与胆固醇结合而对人体有毒性;3.试剂D测得的参考值<64mg·L-1,试剂E结果>参考值,试剂F结果≤参考值,表明受试物有抗真菌作用,其与麦角甾醇直接结合发挥抗真菌作用,该受试物难与胆固醇结合而对人体毒性小,因此可以作为抗真菌剂;4.试剂D测得的参考值<64mg·L-1,试剂E结果≤参考值,试剂F结果>参考值,表明受试物有抗真菌作用,其作用机制尚需进一步研究,该受试物可与胆固醇结合对人体有毒性;5.试剂D测得的参考值<64mg·L-1,试剂E结果≤参考值,试剂F结果≤参考值,表明受试物有抗真菌作用,作用机制及毒性都需进一步研究。本试剂盒可用于筛选不同来源的受试物,包括天然产物、化学合成产物、微生物发酵产物、海洋提取物等。具体实施例方式下面结合具体实施例,对本专利技术作详细描述。实施例1用本专利技术试剂盒检测两性霉素B的抗真菌作用一.配制溶液1.受试物两性霉素B用二甲基亚砜(DMSO)配成6.4毫克/毫升浓度,并倍比稀释成3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625毫克/毫升10个浓度梯度的溶液,4℃保存备用。2.试剂A1摩尔/升Na0H溶液5ml;3.试剂B蛋白胨10克,葡萄糖40克,琼脂18克,加三蒸水900ml溶解,用试剂A调整pH至7.0,定容至1000ml,高压灭菌后制成斜面,4℃保存;4.试剂C酵母浸膏10克,蛋白胨20克,葡萄糖20克,加三蒸水900ml溶解,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存;5.试剂DRPMI 1640 8.0克,碳酸氢钠2.0克,吗啡啉丙磺酸34.5克,加三蒸水900ml溶解,用试剂A调pH至7.0(25℃),定容至1000ml,滤过消毒,4℃保存;6.试剂E含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml,加入上述试剂D溶液1 000毫升,滤过消毒,4℃保存;7.试剂F含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml,加入上述试剂D溶液1000毫升,滤过消毒,4℃保存。二.测定两性霉素B最低抑菌浓度值(MIC80值)接种圈从白色念珠菌保存管中挑取少量白色念珠菌,划线接种于试剂B斜面上,35℃培养24小时。再用接种圈从试剂B斜面上挑取真菌少量,接种至1毫升试剂C,于37℃、250转/分钟振荡培养,活化16小时,使真菌处于指数生长后期。将活化真菌用血细胞计数板计数,分别以试剂D调整菌液浓度至3×105个/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗真菌剂筛选试剂盒,包括盒体与试剂,其特征在于还包括药敏板一块,所说的试剂包括试剂A、B、C、D、E、F各一管:试剂A:1摩尔/升NaOH溶液5ml;试剂B:蛋白胨10克,葡萄糖40克,琼脂18克;试剂C:酵母浸膏10克,蛋白胨20克,葡萄糖20克;试剂D:RPMI16408.0克,碳酸氢钠2.0克,吗啡啉丙磺酸34.5克(0.165摩尔/升);试剂E:含34.63微摩尔/升麦角甾醇的DMSO溶液5ml;试剂F:含34.63微摩尔/升胆固醇的DMSO溶液5ml。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:张军东姜远英曹永兵徐铮高平挥阎澜
申请(专利权)人:中国人民解放军第二军医大学
类型:发明
国别省市:31[中国|上海]

网友询问留言 已有1条评论
  • 来自[北京市百度蜘蛛] 2014年12月09日 21:27
    抗真菌药antifungaldrugs真菌感染可分为表浅真菌感染和深部真菌感染两类表浅感染是由癣菌侵犯皮肤毛发指趾甲等体表部位造成的发病率高危害性较小深部真菌感染是由念珠菌和隐球菌侵犯内脏器官及深部组织造成的发病率低危害性大在所有的抗深部真菌感染药物中只有氟康唑和氟胞嘧啶能透过血脑屏障治疗中枢真菌感染
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