一种β-半乳糖苷酶的固定化方法及其在制备低乳糖牛奶中的应用技术

本发明专利技术公开了一种β‑半乳糖苷酶的固定化方法及其在制备低乳糖牛奶中的应用，是以海藻酸钠作为固定化载体，制备固定化β‑半乳糖苷酶。本发明专利技术获得的固定化β‑半乳糖苷酶的酶活高达438U/mg，用其水解牛奶中乳糖时，仅40min可水解64％的乳糖，循环使用4次，乳糖水解率依然可以保持60％以上。该制备方法工艺简单、成本低廉、速度快、水解率高，具有很好的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种β-半乳糖苷酶的固定化方法及其在制备低乳糖牛奶中的应用
本专利技术属于固定化酶生物催化
，具体涉及一种β-半乳糖苷酶的固定化方法及其在制备低乳糖牛奶中的应用。
技术介绍
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC.3.2.1.23)，全称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶。该酶能水解半乳糖苷键，使乳糖降解为葡萄糖和半乳糖，因此，可以用来生产低乳糖牛奶，为乳糖不耐症人群提供营养。绝大部分β-半乳糖苷酶的催化活性较低，水解牛奶中乳糖的效率不高。例如，中国专利技术专利申请201110170088.8中的游离的β-半乳糖苷酶在最适温度55-60℃条件下水解1h的乳糖水解率仅为32％；中国专利技术专利申请201811395362.X中的游离的β-半乳糖苷酶在10℃条件下7h的乳糖水解率仅为30％。已知水解乳糖能力较好的β-半乳糖苷酶来自Kluyveromycesfragilis菌，加酶量为5500U/L，50min后的乳糖水解率为52.5％(Vieira,D.C.；Lima,L.N.；etal.BiochemicalEngineeringJournal,2013,81:54-64)；还有来自K.lactis菌的β-半乳糖苷酶，虽然在40℃，8h能够彻底水解乳糖，但反应时间过长，容易引起杂菌污染，不利于工业生产(Verma,M.L.；Barrow,C.J.；etal.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2012,50:432-437)。国内外生产低乳糖牛奶主要采用酶水解法，但商业乳糖酶制剂(例如，西安大丰收生物科技有限公司)中都是游离型β-半乳糖苷酶，未见固定化的β-半乳糖苷酶。通常，固定化酶有易回收、重复使用的显著优点，能极大的降低使用成本。而且，牛奶中使用固定化酶，才能不引入非食品源的物质，确保食品安全。目前固定化的β-半乳糖苷酶研究虽有进展，但是都存在不同程度的缺陷。例如，用poly(GMA–MMA)固定的β-半乳糖苷酶，其水解乳糖60h，酶活损失仅12％，但制备材料poly(GMA–MMA)属于化学试剂，有一定毒性，不适于食品工业(Bayramoglu,G.；Tunali,Y.；etal.CatalysisCommunications,2007,8:1094-1101)。用食品级材料明胶固定的β-半乳糖苷酶，4h的乳糖水解率仅为49％，达不到低乳糖牛奶的标准(Puri,M.；Gupta,S.；etal.ApplBiochemBiotechnol,2010,160:98-108)。因此，需要开发一种既满足食品安全又能快速有效的降解牛奶中乳糖的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种β-半乳糖苷酶的固定化方法及其在制备低乳糖牛奶中的应用。本方法是以无毒、无害、食品添加剂之一的海藻酸钠为载体，制备固定化β-半乳糖苷酶。该酶能水解牛奶中的乳糖，制备出符合标准的低乳糖牛奶。本专利技术β-半乳糖苷酶的固定化方法，包括如下步骤：步骤1：按照常规方法将β-半乳糖苷酶目的基因在大肠杆菌BL21中异源表达，经镍柱纯化获得游离β-半乳糖苷酶(Yi,S.H.；Alli,I.；etal.NewBiotechnology,2011,28:806-813)；步骤2：以50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液配制46.3mM的海藻酸钠溶液，将酶液与海藻酸钠溶液等体积混合；步骤3：将步骤2获得的混合液以体积比1:10、2d/s的速度滴入180.2mM的CaCl2中，然后室温下静置1-2h，形成硬化的固定化酶颗粒，即β-半乳糖苷酶的固定化酶。步骤2中，酶液的浓度为0.1mg/mL；酶液与海藻酸钠溶液等体积混合时的混合条件为：保持温度为0℃以及50-60rpm的搅拌速度。本专利技术最佳固定化条件为：海藻酸钠浓度46.3mM，CaCl2浓度180.2mM，初始加酶量73U/mL。本专利技术获得的酶颗粒直径在1.5±0.02mm之间，能通过滤纸过滤回收。一颗固定化β-半乳糖苷酶颗粒的重量为22±2mg，包埋了0.12±0.003U酶。本专利技术固定化β-半乳糖苷酶，无毒，最适温度为65℃、最适pH为6.5，4℃保存12h，酶活能保持固定化酶的83％，即363.5U/mg。本专利技术制备的固定化β-半乳糖苷酶的应用，是用于制备低乳糖牛奶，具体包括如下步骤：以普通常规牛奶为底物，加酶2.4U/mL，在65℃、150rpm振荡器中反应，反应40min后，残留乳糖浓度降为1.5±0.03g/100mL，即乳糖水解率达到64.8％，符合低乳糖牛奶的标准(中华人民共和国国家标准GB28050-2011中规定，低乳糖牛奶的标准为乳糖含量≤2g/100mL)。本专利技术固定化β-半乳糖苷酶可以循环使用，按照上文中步骤3的方法反应后，用滤纸过滤牛奶，回收固定化β-半乳糖苷酶颗粒。用50mMpH6.5磷酸盐缓冲液洗涤颗粒1次，再加入新鲜牛奶。如此循环使用4次后，残留乳糖浓度为1.70±0.02g/100mL，依然达到低乳糖牛奶的标准。所述普通常规牛奶的乳糖浓度为4.26±0.02g/100mL。本专利技术β-半乳糖苷酶的固定化载体是海藻酸钠，制备得到的固定化β-半乳糖苷酶的酶活高达438U/mg，用其水解牛奶中乳糖时，仅40min可水解64％的乳糖，循环使用4次，乳糖水解率依然可以保持60％以上。该制备方法工艺简单、成本低廉、速度快、水解率高，具有很好的工业应用价值。附图说明图1表示了本专利技术的海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶的海藻酸钠浓度优化曲线。图2表示了本专利技术的海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶的氯化钙浓度优化曲线。图3表示了本专利技术的海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶的加酶量优化曲线。图4表示了本专利技术的海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶的最适温度曲线。图5表示了本专利技术的海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶的最适pH曲线。图6表示了本专利技术的海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶水解牛奶中乳糖的水解率图。图7表示了本专利技术的海藻酸钠固定化β-半乳糖苷酶水解牛奶中乳糖的重复利用图。具体实施方式实施例1：β-半乳糖苷酶的固定化条件优化现用磷酸盐缓冲液配制23.2mM的海藻酸钠溶液，将1mL酶液(酶浓度0.04mg/mL)加入到1mL海藻酸钠溶液中，放在冰浴中(0℃)，以50-60rpm的速度搅拌。用注射器吸取混合溶液以2d/s的速度滴加到20mL90.1mMCaCl2溶液中，形成海藻酸钙珠。得到固定化酶颗粒后，继续室温放置1-2h，使其硬化，最后用50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液清洗颗粒，除去未结合上的酶分子，得到β-半乳糖苷酶的固定化酶，放在冰箱4℃保存。其中海藻酸钠浓度、CaCl2浓度以及初始加酶量都需要进行优化，如图1、图2、图3所示，结果表明当海藻酸钠浓度为46.3mM、CaCl2浓度为180.2mM以及初始加酶量为73U/mL时固定化率最高，即重量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于：/n以海藻酸钠作为固定化载体，制备固定化β-半乳糖苷酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于：
以海藻酸钠作为固定化载体，制备固定化β-半乳糖苷酶。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：按照常规方法将β-半乳糖苷酶目的基因在大肠杆菌BL21中异源表达，经镍柱纯化获得游离β-半乳糖苷酶
步骤2：以50mMpH6.5的磷酸盐缓冲液配制海藻酸钠溶液，将酶液与海藻酸钠溶液等体积混合；
步骤3：将步骤2获得的混合液以2d/s的速度滴入CaCl2溶液中，然后室温下静置1-2h，形成硬化的固定化酶颗粒，即β-半乳糖苷酶的固定化酶。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤2中，酶液的浓度为0.1mg/mL，海藻酸钠溶液的浓度为46.3mM。


4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
步骤2中，酶液与海藻酸钠溶液等体积混合时的混合条件为：保持温度为0℃以及50-60rpm的搅拌速度。


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【专利技术属性】
技术研发人员：彭惠，华珍，孔慧慧，高毅，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34