一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体及其在人工驯化栽培中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体及其在人工驯化栽培中的应用。该肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.18584。本发明专利技术涉及的肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体可采用玉米粉培养基平板继代扩繁，可采用小米粒培养基制作栽培菌种，可采用玉米芯培养料及熟料袋栽模式获得子实体。本发明专利技术提供了一种野生食药用菌的纯培养菌丝体及人工栽培方法，且该菌丝体为高温型，适合夏秋高温季节人工栽培，不仅为食用菌产业提供了新品种，而且对保护野生蕈菌的多样性也具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体及其在人工驯化栽培中的应用
本专利技术属食用菌栽培领域，具体涉及一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体及其在人工驯化栽培中的应用。
技术介绍
肉质黑孢孔菌(Amylosporussucculentus)属于黑孢孔菌属，该属于1973年由Ryvarden建立，其模式种为坎氏黑孢孔菌(A.campbellii)。野生肉质黑孢孔菌主要分布于热带地区，子实体为一年生，新鲜子实体为肉质，干品为木栓质。子实体菌盖圆形，边缘较薄、波浪形，表面颜色白色或淡粉色；菌褶为孔状，孔口形状为多角形，颜色为浅黄色，易破碎。孢子椭圆形、无色，细胞壁稍厚，表面粗糙。肉质黑孢孔菌发现较晚，至今对其生物学特性及驯化栽培研究均鲜有报道。2018年，黄福常等报道了黑孢孔菌属的另一个种——纹盖黑孢孔菌(Amylosporussulcatus)并对其人工驯化栽培及子实体营养情况进行了研究，认为纹盖黑孢孔菌可作为新的食用菌品种进行开发利用。纹盖黑孢孔菌与肉质黑孢孔菌在分类学上为黑孢孔菌属的两个独立种。2017年8月，专利技术人在河北省燕山地区进行野生大型真菌资源调查时，采集到的该菌子实体并分离获得纯培养菌丝体，同时开展了驯化栽培研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体及其在人工驯化栽培中的应用。实现本专利技术的目的采取的技术方案是这样的：首先获得肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体并对其真实性进行鉴定；成功获得纯培养菌丝体后，若实现人工驯化栽培第一步就要筛选其最适合生长的培养基，实现菌种扩繁，然后根据对其生活环境特点进行人工驯化栽培，具体如下：(1)肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体获得与鉴定以采集到的野生肉质黑孢孔菌子实体为材料，通过组织分离技术，从子实体菌盖中部取规格为2×2×2mm大小的组织块，接种到常规PDA试管斜面培养基上，在20～25℃培养箱中进行避光培养，10～15d后获得长满试管斜面培养基的菌丝体，于4℃冰箱中保存备用。对获得的菌丝体进行ITS鉴定，同时对菌丝体来源的子实体进行同样ITS鉴定。采用真菌DNA提取试剂盒，分别制备菌丝体DNA和子实体DNA，然后，分别以2种DNA为模板，建立包含ITS引物在内的PCR扩增体系，将获得的扩增产物进行测序，测序得到的ITS序列于NCBI的数据库进行BLAST比对分析，最终确定获得的菌丝体与子实体的ITS序列相同，证明菌丝体来源于子实体；且其与数据库中的肉质黑孢孔菌ITS序列高度同源，故将获得的纯培养菌丝体和子实体鉴定为肉质黑孢孔菌。获得的肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体，现在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物所。保藏编号为：CGMCCNo.18584。保藏日期为2019年10月10日，分类命名为：Amylosporussucculentus。(2)菌丝体的继代扩繁从冰箱保藏的肉质黑孢孔菌菌丝体试管斜面培养基上挑取规格为2×2mm大小的菌丝体块，接种于PDA平板培养基上，在20～25℃条件下，经过15-20d培养后，使用直径为0.7cm的圆形打孔器沿菌丝体菌落边缘打孔取菌片，将圆形菌片接种于玉米粉培养基平板上继代扩繁，在20～25℃、避光培养条件下，15～20d后获得长满菌丝体的平板扩繁菌种。实现的了菌丝体的继代扩繁。(3)驯化栽培菌种制备从长满菌丝体的扩繁菌种平板上挑取直径1.5cm～2cm菌丝体块3～5块，接种于经灭菌处理的小米粒培养基中，在28～31℃温度条件下避光培养，30～40d后获得长满菌丝体的栽培菌种。(4)播种与发菌培养在无菌条件下，将小米粒栽培种均匀散播在装有灭菌处理的玉米芯培养料的塑料袋表面，接种量为培养料重量的10％～15％。接种结束，系紧菌袋，在20～25℃发菌室中进行避光培养，20～25d后获得长满菌丝体的栽培菌袋。(5)出菇培养将栽培菌袋转入出菇棚后，打开袋口，通过地面洒水、空间喷雾增加菇棚空气相对湿度到85～90％，增加通风换气，增加散射光照，加大昼夜温差刺激，菇棚温度保持在25～33℃，10～15d后在塑料袋料面看到原基形成；原基形成后，继续保持相同湿度，减少昼夜温差刺激，恒温25～26℃，同时，加强散射光照和通风换气管理，原基逐渐长大成子实体；当菌棒发软时，进行子实体的采收。在步骤(1)中所述的PDA培养基的配方组成为：去皮土豆200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨2.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、无水硫酸镁1.5g/L、琼脂粉20g/L、水1L。所述的PDA培养基的灭菌条件为：高压灭菌锅121℃、灭菌时间20min。在步骤(2)中所述的PDA培养基配方为：去皮土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉20g/L、水1L、pH5～6。玉米粉培养基配方组成为：玉米粉20g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨2.5g/L、磷酸二氢钾3g/L、无水硫酸镁1.5g/L、琼脂粉20g/L、水1L、pH5～6。所述的PDA培养基与玉米粉培养基的灭菌条件均为：高压灭菌锅121℃、灭菌时间20min。在步骤(3)中所述的小米粒培养基配方组成为：小米粒含量96～98％、葡萄糖1～2％、石膏1～2％，含水量60～65％。所述的小米粒培养基的灭菌条件为：高压灭菌锅121℃、灭菌时间1.5h～2h。在步骤(4)中所述的玉米芯培养基配方为：玉米芯78％、麸皮20％、石膏1％、糖1％、含水量60～65％、pH自然。所述的菌袋规格为:14cm×28cm×0.05cm，培养料的装入量为300～400g/袋(湿重)。所述的玉米芯培养基的灭菌条件为：高压灭菌锅121℃、灭菌时间2h。本专利技术取得的有益效果如下：(1)本专利技术涉及的肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体未见报道，其可作为菌种用于肉质黑孢孔菌的驯化栽培，不仅为食用菌产业提供了新品种，而且对保护野生蕈菌的多样性也具有重要意义。(2)所涉及的肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体在菌种扩繁培养及出菇试验中，在多种培养基均可生长，表明获得菌丝体的适应性较强，可采用培养基轮换使用，来避免该菌种老化、退化；菌丝体为高温型菌种，适合夏秋高温季节人工栽培，为食用菌产业提供了一个高温食药用菌新品种及栽培方法。附图说明附图1：分离菌丝体ITS序列比对图。附图2：肉质黑孢孔菌菌丝体在不同扩繁平板培养基上的生长状况。附图3：肉质黑孢孔菌菌丝体在不同菌种培养基上的生长状况。附图4：肉质黑孢孔菌菌丝体在不同培养料上的生长状况。附图5：不同培养温度对肉质黑孢孔菌菌丝体生长速度的影响。附图6：肉质黑孢孔菌菌丝体出菇后形成的子实体。附图7：PCR扩增程序。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术。实施例1肉质黑孢孔菌菌丝体纯培养物的分离培养与鉴定对采集到的野生肉质黑孢孔菌子实体进行组织分离。组织分离菌块的规格为2×2×2mm立方大小，所取组织块部位为子实体菌盖中部，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体,其特征在于，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为：CGMCC No.18584。/n

【技术特征摘要】
1.一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体,其特征在于，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为：CGMCCNo.18584。


2.一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体的应用，其特征在于，作为人工驯化栽培肉质黑孢孔菌的菌种并进行扩繁，方法如下：
从保藏试管斜面培养基上挑取规格为2×2mm大小的肉质黑孢孔菌菌丝体块，接种于PDA培养基平板上，在20～25℃条件下，培养15～20d，使用直径为0.7cm的圆形打孔器沿菌丝体菌落边缘打孔取菌片，将圆形菌片接种于玉米粉培养基平板上继代扩繁，在20～25℃、避光培养条件下，15～20d后获得长满菌丝体的平板扩繁菌种。


3.一种肉质黑孢孔菌纯培养菌丝体的应用，其特征在于，其扩繁菌种用于人工驯化栽培肉质黑孢孔菌栽培种的制作，方法如下：
从长满菌丝体的扩繁菌种平板上挑取直径1.5～2cm菌丝体块3～5块，接种于经灭菌处理的小米粒培养基中，在28～31℃温度条件下避光培养，30～40d后获得长满菌丝体的栽培菌种。


4.一种肉质黑孢孔菌的纯培养菌丝体的应用，其特征在于其栽培菌种用于肉质黑孢孔菌人工驯化栽培过程并获得子实体，方法如下：
(1)播种与发菌培养
在无菌条件下，将小米粒栽培种均匀散播在装...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立安，张金秀，赵立强，史玲玉，徐鲲，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：河北;13