凝胶电泳分离血清脂蛋白及其量化检测的新方法技术

本发明专利技术凝胶电泳分离血清脂蛋白及其量化检测的新方法，涉及有效表达血清脂蛋白代谢平衡状态的实用方法，广泛用于医学检测及研究。本发明专利技术一种凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，在电泳槽中形成温度梯度，对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离，其中，所述的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶浓度分别为：分离胶１为３．０％；分离胶２为３．６％；分离胶３为７．０％。本发明专利技术达到了以往方法所不能达到的效果，具有操作简便、性能优越、应用前景良好的特点，在技术和性能上克服以往技术难题，成功建立了ｓｄ－ＰＡＧＥ新方法和ＳＬＰＧ新指标，效果理想。实现了血脂脂蛋白的整体分析－血清脂蛋白代谢动态平衡。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术，涉及有效表达血清脂蛋白代谢平衡状态的实用方法，广泛用于医学检测及研究。
技术介绍
血清脂蛋白具有特殊的颗粒结构，其组成复杂而不均一，在代谢过程中不断按序演变和物质交换，通常处于协调的动态平衡状态。异常脂蛋白血症与心脑血管病的关系密切，临床上非常重视。多年来检测血清脂蛋白的方法不断改进，如梯度凝胶电泳，但临床上一直缺乏有效表达血清脂蛋白代谢平衡状态的实用方法。主要存在三个问题一、由于不同种类血清脂蛋白的颗粒特性差异悬殊，使单一方法的实验条件难以兼顾，同步表达它们的能力弱，通常采用相互分立的方法分别进行检测。二、由于分析过程的参比系不统一，使分别测定的结果不能放在统一的血清脂蛋白整体中比较其相互联系。三、由于实验条件要求较高，如稳定的线性浓度梯度，难以适应临床检验工作的需要。目前国内外研究现状 第一、血脂因素的孤立分析冠心病的病理基础是动脉粥样硬化，血脂异常是其关键的危险因素。表达血脂状态的指标很多，临床常用的有甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，以及载脂蛋白(Apo)和脂蛋白(a)等。从孤立的血脂因素进行分析，临床现状不容乐观。人们的平均血脂水平随生活水平的提高而有明显升高趋势。2001年调查发现我国94.9％冠心病伴高脂血症患者未能得到理想的血脂控制。部分患者的血脂水平始终不高，或者即使将血脂控制在合适范围，也难以阻止其冠脉病变发展进程。因此，理论上难以从孤立的血脂因素来解释患者的发病机制。存在如下一些问题(一)忽视了血清脂蛋白颗粒结构的完整性，血清脂蛋白在保持完整颗粒结构的前提下发挥其生理功能。不同种类脂蛋白的构成有明显差异。临床常用血脂指标只是笼统的表达，并不能反映它们在各种脂蛋白中的具体含量。孤立因素如胆固醇(Chol)并不能反映脂蛋白颗粒的全貌。同样是Chol却有好坏之分，其实质为携带之脂蛋白(如HDL和LDL)的颗粒特性有别。若脂蛋白颗粒发生异常，将Chol运输和堆积到不应该的部位(如巨噬细胞内和血管壁)，从而导致病理改变。(二)忽视了血清脂蛋白代谢的整体性，血清脂蛋白的组成复杂而不均一，其代谢通常处于协调的平衡状态。因缺乏量化表达的有效指标，调脂治疗尚未从调节血清脂蛋白代谢的整体角度着手，而局限于降低TG、TC、LDL-C和升高HDL-C等分立指标上。(三)忽视了血清游离脂肪酸(FFA)，由于脂肪酸不溶于水，整个细胞外游离脂肪酸(FFA)的运输过程主要靠非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)来完成。AL-NEFA参与血脂代谢，具有重要的生物学意义，直接影响血小板、粒性白细胞的功能以及某些酶促活性。但临床血脂检验基本忽视了本属于血脂范畴的FFA或AL-NEFA成分。(四)针对HDL的认识和措施有限，HDL通过胆固醇逆转运(RCT)途径将外周细胞内多余的Chol转运至肝脏或固醇代谢器官，对防治动脉粥样硬化有意义。但对HDL亚组分颗粒特性的认识有限，临床上尚缺乏有显效升高HDL的措施，亟待解决。研究HDL亚组分，寻找调节RCT的新药物，是临床血脂研究发展的一大趋势。第二、血脂因素的组合分析，由于以往孤立分析有局限性，临床血脂研究逐渐往横向发展，出现多个因素的组合分析，如“脂谱”和“脂蛋白谱”，试图从多因素的角度综合评价血脂代谢状态。其中倍受关注的是“致动脉粥样硬化性脂蛋白谱”(ALP)，它是指有一定遗传基础的几种代谢异常的综合，主要表现sLDL增多，高TG血症及低HDL-C，常伴有胰岛素抵抗为基础的代谢综合征。这些“谱”是多指标的组合，各项指标之间来源不同，单位有别，不具备“光谱”、“电泳谱”等有严谨科学含义的“谱”的特征。孤立指标组合所表达的仍然是血脂代谢的某些因素，并不能表达血清脂蛋白平衡状态的整体概貌。(一)理论认识方面(1)血液中散布的有形成分有红白细胞、血小板、脂蛋白和更细微的物质。它们在形态上逐渐由大到小，由细胞向非细胞过渡。血清脂蛋白具有特殊的颗粒结构，组成复杂而不均一，发挥着重要的生理功能。我们认为，血清脂蛋白是一组非细胞形态的结构和功能单位。临床分析应重视它们颗粒结构的完整性，而非局限于局部组成因素。(2)血清中不同种类脂蛋白颗粒的结构和功能存在明显差异，相互之间时刻进行着脂质和Apo的转移或交换。血清各种脂蛋白颗粒都有各自生成、发展和消亡的过程，其代谢受多种功能蛋白的调节而处于复杂而有序的平衡状态，维持着各自质与量的相对稳定，并随时间变化而动态改变，称为血清脂蛋白动态平衡。这种动态平衡失调是血脂异常的一种表现形式，可能是导致疾病发生和发展的一个重要环节。调脂治疗应注重整体，试以调节血清脂蛋白动态平衡为关键，而非局限于降低或升高局部因素。(二)以往方法学存在的主要问题有(1)分离方法相互分立式，难以进行同步分离。由于不同种类血清脂蛋白的颗粒特性差异悬殊，使电泳条件的设置难以兼顾，同步表达能力差。(2)分析方法无统一参比，不能进行统一比较。由于忽略了“参比系惟一性”的实验原则，使测定结果缺乏相互可比性，对血清脂蛋白代谢平衡状态无法统一地进行总体评估。我们从整体的角度探索改良方法的途径，为此，提出新的技术方案。
技术实现思路
本专利技术目的在于，提供一种凝胶电泳分离血清脂蛋白的方法，并对其进行量化检测的分析，以同步和量化表达血清脂蛋白整体的平衡关系，而非局限于某些组分或亚组分。本专利技术的目的通过下述方案实现一种凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，在电泳槽中形成温度梯度，对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离，其中，所述的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶浓度分别为分离胶1为3.0％；分离胶2为3.6％；分离胶3为7.0％。本专利技术建立了分段浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳(sd-PAGE)的新方法，该法以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，利用非线性浓度梯度来调控不同分离胶的分子筛大小，使之分别与不同颗粒大小的脂蛋白相匹配。电泳方法的结果是将苏丹黑B预染的血清同步分离出11-12条清晰区带，按序先后为前清蛋白(pre-AL)、非酯化脂肪酸清蛋白(AL-NEFA)、高密度脂蛋白1-5(HDL1-5)、低密度脂蛋白(LDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、极低密度脂蛋白1-2(VLDL1-2)以及在原点区内可能滞留的乳糜微粒(CM)。在上述方案基础上，对凝胶电泳分离血清脂蛋白方法进行量化检测，即电泳结束立即取下凝胶管，用双波段飞点扫描仪和光学扫描仪分别对凝胶管进行扫描和成像，飞点扫描单色光波长为604nm，以空白凝胶为统一参比，扫描时沿凝胶管的中央轴线，从空白区向原点的方向进行，分析时以相邻电泳峰之间的拐点作为分段标志，仪器自动算出各电泳峰下面积占血清脂蛋白整体的百分含量，血清脂蛋白及其亚组分的扫描图谱和量化结果制成血清脂蛋白谱。其扫描图谱和定量数据称之为血清脂蛋白谱(SLPG)，直观而具体地表达各种血清脂蛋白的相对含量，理想地表达了它们在血清代谢中的相互平衡关系。SLPG各项指标的检测稳定性好，批内变异系数(CV)为1.20％-6.54％。本专利技术优越性在于操作简便，性能优越，应用前景良好，在技术和性能上克服以往技术难题，达到了以往方法所不能达到的效果。本专利技术成功建立了sd-PAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凝胶电泳分离血清脂蛋白方法，以三种不同浓度的分段聚丙烯酰胺凝胶作为电泳载体，在电泳槽中形成温度梯度，对血清脂蛋白及其亚组分做同步电泳分离，其中，所述的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶浓度分别为：分离胶１为３．０％；分离胶２为３．６％；分离胶３为７．０％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈允钦，尹恝，
申请(专利权)人：陈允钦，尹恝，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]