一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用制造技术

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用，所述试剂盒含有：（a）一抗：GPC3单克隆抗体工作液，所述GPC3单克隆抗体为鼠源GPC3抗体或人源GPC3抗体；（b）二抗：HRP标记羊抗鼠IgG抗体工作液；（c）DAB显色液A缓冲液和DAB显色液B缓冲液；（d）苏木素细胞染色液；（e）组织抗原修复液；（f）2‑3％体积比的H

【技术实现步骤摘要】
一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子生物学、医学免疫学与体外血清学诊断
，具体地说涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用，通过建立可以用于临床病理诊断的试剂盒，来验证该抗体的临床适用性。
技术介绍
肝细胞癌(hepatocellularCarcinoma，HCC)是目前全世界发病率很高的第五大癌症，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。目前外科手术切除肿瘤仍是治疗HCC最好、最快捷的方法。然而，大多数患者就诊时已失去了最佳治疗时机，能够早期手术切除者只占10-20％，即使手术切除，复发率仍很高。所以早期发现、早期诊断、早期治疗HCC是提高患者生存率的关键，也是预后和治疗的关键。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)，其基因位于人染色体X26q1,长900kb，GPC3开放阅读框有1740bp,编码580个氨基酸，分子量为66kD。GPC3基因编码的蛋白属于硫酸已酰肝素蛋白聚糖(HeparanSulfateProteoglycans，HSPGs)，通过糖基磷脂酰蛋白(glycosyl-phosphatidylinositolAnchor,CPI)锚定在细胞表面，可结合生长因子等，调控着细胞生长、繁殖、分化、黏附和迁移等行为。研究证实GPC3蛋白在肝癌组织中高表达，而在非癌组织中没有表达或表达极少，并能在血清中检测到GPC3的含量，用免疫组化的方法检测肝癌患者的GPC3阳性率在90％以上，而其他良性肝病和正常肝组织中表达率为极低，其特异性能达到96％以上。另外，GPC3在对于HCC在血清中的检出率明显高于AFP，两者分别是76.3％和31.3％。因此，GPC3对HCC的诊断率明显高于AFP，尤其在AFP阴性的早期肝癌的诊断中发挥重要作用。GPC3作为一种新的生物学指标，目前临床上暂时没有针对其的检测方法，在监测肿瘤的发生发展中的应用还属空白，而之所以这个空白很难突破，在于GPC3蛋白很难通过体外重组方式进行表达，更会影响抗体的制备，我们构建了可以稳定表达GPC3蛋白的细胞系，用该细胞系表达的蛋白进行免疫小鼠，筛选制备出可以表达效价较高的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。由于杂交瘤细胞有丢失高特异性高活性的风险，或者细胞状态不好乃至死亡。而经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，可以以重组蛋白的方式来稳定获得抗体；从而使得研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该抗体，而可以以碱基序列的形式进行保存和传播交流、鉴定。我们将该GPC3单克隆抗体克隆株进行测序处理加工修饰后，再通过构建的人源化抗体重组表达载体，在公司验证的稳定细胞系进行抗体的大量表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒及其应用，要解决现有技术肝癌诊断不灵敏的技术问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：(a)一抗：GPC3单克隆抗体工作液，所述GPC3单克隆抗体为鼠源GPC3抗体或人源GPC3抗体，两种抗体皆为本实验室制备；(b)二抗：HRP标记羊抗鼠IgG抗体工作液；(c)DAB显色液A缓冲液和DAB显色液B缓冲液；(d)苏木素细胞染色液；(e)组织抗原修复液；(f)2-3％体积比的H2O2；进一步优选地，所述鼠源GPC3抗体的制备方法包括如下步骤：(a)动物免疫：通过亲和层析和离子交换层对GPC3蛋白进行纯化后，浓缩至5mg/ml，将GPC3蛋白抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫BALb/c小鼠，0.2mg/只，0天免疫为弗氏完全佐剂，末次免疫一周后采血，通过间接ELISA检测抗体效价，末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠即为备用融合小鼠；(b)细胞融合：复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液，重新添加培养液，取步骤(a)中选用的备用融合小鼠的脾细胞制备小鼠脾细胞悬浮液和本实验室保存的SP2/0细胞进行融合；(c)单克隆抗体的大量制备：ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，将阳性孔细胞转入24孔板进行扩大培养，并及时进行亚克隆经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系；获得细胞免疫小鼠的腹水，纯化后得到GPC3单克隆抗体。进一步地，所述动物免疫具体包括：GPC3蛋白纯化后，监测波长为280nm，收集洗脱峰，取少量洗脱蛋白液做电泳分析，其余用0.85％的NaCl溶液在4℃透析48h，之后用超滤膜浓缩至5mg/ml，将磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫Balb/c小鼠，0.2mg/只，末次免疫一周后采血，间接ELISA检测血清中抗体效价，血清稀释104倍时OD值为1.089，于末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。进一步优选地，所述细胞融合具体包括：(a)复苏SP2/0细胞株和准备小鼠脾细胞悬液：细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液，重新添加培养液，SP2/0细胞准备完成；处死免疫小鼠，按常规方法制备小鼠脾细胞悬液；(b)细胞混匀准备：脾细胞与SP2/0细胞计数结果分别加入适量不完全DMEM培养液，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀，然后将脾细胞与SP2/0细胞按1:2合于50ml离心管中，混匀，再加不完全DMEM培养液至50ml，离心5钟，倒净上清，轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合；(c)细胞融合：将37℃预热的50％的PEG4000lml，用滴管缓慢滴入混合细胞管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态，静置90s后立即缓慢加入15ml37℃无血清的DMEM培养基，然后离心5钟，弃去上清，再加入DMEM完全培养液，混勾，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，100μl/孔，于37℃培养箱内培养，次日细胞板加HAT培养液100μl/孔，每3天换一次HAT培养液，观察是否出现杂交瘤，两周后换HT培养基，观察融合细胞生长状况。一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒的应用，其特征在于，用于临床肝癌诊断。与现有技术相比本专利技术具有以下特点和有益效果：本专利技术实用表达纯化后GPC3抗体构建了可以用于病理诊断的免疫组化试剂盒，通过检测临床病理切片，验证该试剂盒在肝癌诊断的临床应用性能，结果表明，本专利技术涉及的试剂盒在肝癌诊断方面有极好的特异性，可以用于有效的排除肝癌诊断的假阳性结果，有很好的临床适用性。本专利技术涉及的检测试剂盒具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，不仅可以区分癌变组织和正常组织，还可以区分癌变组织中癌变的细胞和正常的细胞；GPC3在正常肝细胞中呈阴性表达染色，而在癌变细胞细胞浆和细胞膜中呈阳性表达，有效地区分肝癌变细胞和正常细胞，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：/n（a）一抗：GPC3单克隆抗体工作液，所述GPC3单克隆抗体为鼠源GPC3抗体或人源GPC3抗体；/n（b）二抗：HRP标记羊抗鼠IgG抗体工作液；/n（c）DAB显色液A缓冲液和DAB显色液B缓冲液；/n（d）苏木素细胞染色液；/n（e）组织抗原修复液；/n（f）2-3％体积比的H

【技术特征摘要】
1.一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
（a）一抗：GPC3单克隆抗体工作液，所述GPC3单克隆抗体为鼠源GPC3抗体或人源GPC3抗体；
（b）二抗：HRP标记羊抗鼠IgG抗体工作液；
（c）DAB显色液A缓冲液和DAB显色液B缓冲液；
（d）苏木素细胞染色液；
（e）组织抗原修复液；
（f）2-3％体积比的H2O2。


2.如权利要求1所述的一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述鼠源GPC3抗体的制备方法包括如下步骤：
(a)动物免疫：通过亲和层析和离子交换层对GPC3蛋白进行纯化后，浓缩至5mg/ml，将GPC3蛋白抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化后于0天、14天、28天、35天背部皮下多点免疫BALb/c小鼠，0.2mg/只，0天免疫为弗氏完全佐剂，末次免疫一周后采血，通过间接ELISA检测抗体效价，末次免疫一周后采用乙肝疫苗原液腹腔冲击选定的小鼠即为备用融合小鼠；
（b）细胞融合：复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI1640细胞培养液，重新添加培养液，取步骤（a）中选用的备用融合小鼠的脾细胞制备小鼠脾细胞悬浮液和本实验室保存的SP2/0细胞进行融合；
（c）单克隆抗体的大量制备：ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，将阳性孔细胞转入24孔板进行扩大培养，并及时进行亚克隆经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系；获得细胞免疫小鼠的腹水，纯化后得到GPC3单克隆抗体。


3.如权利要求2所述的一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测试剂盒，其特征在于，所述动物免疫具体包括：GPC3蛋白纯化后，监测波长为280nm，收集洗脱峰，取少量洗脱蛋白液做电泳分析，其余用0.85%的NaCl溶液在4℃透析48h，之后...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，赵树杰，
申请(专利权)人：南京拂晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32