一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术属于医药生物领域，公开了一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其中含有琼脂糖凝胶板、Ｔｒｉｓ缓冲液、巴比妥钠－巴比妥电泳缓冲液、底物、底物缓冲液和显色剂；本发明专利技术还公开了一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒的制备方法，采用本发明专利技术的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒鉴定血清标本，可以避免因免疫抑制法检测ＣＫ－ＭＢ时所造成的假阳性的发生，为临床提供正确的检测报告，为肿瘤的早期诊断提供新的肿瘤标志物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物领域，涉及一种试剂盒及其制备方法，更特别的，本专利技术涉及一种可用于临床疾病检测的。
技术介绍
肌酸激酶(CK)是由M和B亚单位组成的二聚体，在细胞质内共有三种同工酶CK-MM、CK-MB和CK-BB。在细胞线粒体内还有另一种同工酶，称为CK-Mt(又称巨CK)。巨CK又分为巨CK1和巨CK2。巨CK1是一种CK同工酶与自身抗体的复合物，因其分子量大，在体内不易排出，又因其有较长的半衰期，故在血中存留时间较长。文献认为CK1与疾病无明显联系，甚至有的在健康人血中检出巨CK1。巨CK2是一种低聚的线粒体CK，不会在健康人血中出现，近年来由于其在某些肿瘤病人血清中的高检出率而使国外众多研究者一致认为它与恶性肿瘤密切相关，可作为一种新的肿瘤标志物。CK-BB存在于健康人脑组织，胃肠道和子宫平滑肌内，正常人血清中无CK-BB。组织坏死或某些恶性肿瘤时可出现血清CK-BB升高，在血清中升高通常提示肿瘤扩展或对治疗的应答。免疫抑制法检测CK-MB作为早期诊断急性心肌梗死的特异性指标已被临床广泛应用，其测定原理是用抗CK-M抗体将M亚基抑制，测定B亚基，结果乘2即为CK-MB活性。而当血清中出现正常人不含有或含量甚微的巨CK或CK-BB时，由于它们不受抗M亚基抗体抑制，其活性已百分之百测出，再乘上系数2，就会出现“CK-MB”等于或高于总CK活性的现象(事实上，CK-MB活性占总CK活性的比例很少出现30％以上)。极易将健康人或肿瘤患者误诊为心脏病病人入院治疗，造成病人严重的精神负担，浪费不必要的医疗费用和延误肿瘤患者的早期诊断。目前随着检验技术的不断改善，全自动生化仪在中小型医院也越来越普及，巨CK或CK-BB对临床检验结果所造成的干扰越来越明确。已经严重影响检验结果的正确性，造成对酶测定结果的错误判断，甚至引起不必要的医疗纠纷。因此，临床上需要找到一种更准确、可避免因免疫抑制法检测CK-MB时所造成的假阳性的发生的检测方法。目前，美国海伦那及法国西比亚公司研制除了配套全自动(半自动)电泳仪用琼脂糖电泳试剂盒，也可用于检测巨肌酸激酶。其主要结构为全自动(半自动)电泳仪、琼脂糖凝胶板、样品杯(样品梳)、试剂底物、显色剂等。血清样品加至样品杯内(样品梳圆孔内)，放置样品架上备用，另取一片琼脂糖凝胶板放在电泳板上，琼脂板两侧各放一根碳棒(浸透缓冲液的膜条)，另配置一小瓶试剂底物放入试剂槽内(由样品板小孔内注入)，事先定好测定程序，按下开关即开始电泳。但是，上述全自动或半自动电泳仪价格昂贵，一般医院不能购买，另外其专用配套试剂盒不能小批量标本检测，目前推销的试剂盒最小包装量一次检测8个标本，如标本少于8份，成本将大大提高，而临床上往往是发现一例可疑标本需即刻进行鉴定，因此，不适合鉴定用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，应用本专利技术的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒鉴定血清标本，可以避免因免疫抑制法检测CK-MB时所造成的假阳性的发生，为临床提供正确的检测报告，为肿瘤的早期诊断提供新的肿瘤标志物。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是提供一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其中含有琼脂糖凝胶板、Tris缓冲液、巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液、底物、底物缓冲液和显色剂，在每1000ml所述的Tris缓冲液中，含有20mmolTris，14克蔗糖，500毫克叠氮钠，4-6gL-天冬酸干粉；所述的琼脂糖凝胶板中含有1％的琼脂糖；在每升所述的巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液中含有10.3克巴比妥钠，1.84克巴比妥；在每升所述的底物中含有4.0mmolADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol酸肌酸钠，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，40mmolN-乙酰半胱氨酸；在每升所述的底物缓冲液中含有20mmol的咪唑，40mmol的葡萄糖，20mmol的醋酸镁，4.0mmolEDTA；每1ml所述的显色剂中含有氯化硝基四氮唑蓝2mg，吩嗪二甲酯硫酸盐0.1mg。优选的，所述的Tris缓冲液的PH值为7.4。优选的，所述的巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液的PH8.6。优选的，所述的底物缓冲液的PH值为6.7。本专利技术的目的还在于提供一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒的制备方法，包括以下步骤(1)配制PH7.4Tris缓冲液称取20mmolTris，14克蔗糖，500毫克叠氮钠，然后放置于容器中，再加入约800ml蒸馏水搅拌，将容器置于37℃水箱内，再向容器内加L-天冬酸干粉，边加边搅拌溶解，用PH试纸条粗调PH约7.4，最后用PH测定仪调整PH值至7.4，加水至1000ml；(2)制备1％琼脂糖凝胶称取1克琼脂糖，加热溶解于PH为7.4的Tris缓冲液100ml中，分装8ml/管；(3)制备琼脂糖凝胶板取出8ml/管1％琼脂糖凝胶，隔水加热溶解，在铁板上放一片110mm×80mm透明的聚酯膜作支撑，上面压一块中间挖有100mm×70mm×1mm大小孔的硅胶片，四周与聚酯膜用水贴紧，将加热溶解的8ml琼脂糖倒入孔内，顺势用管底将琼脂糖铺平，待冷却后，揭去硅胶片洗净待用，在凝胶板上覆盖一张保鲜膜，取下凝胶板，放入一密封的塑料盒内；(4)制备PH8.6，0.05mol/L巴比妥钠-巴比妥电泳缓冲液称取巴比妥钠10.3克，巴比妥1.84克溶于1L蒸馏水中；(5)制备底物将4.0mmol LADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol磷酸肌酸钠，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U6-磷酸葡萄糖脱氢酶，40mmolN-乙酰半胱氨酸加入1L蒸馏水中混合；(6)制备底物缓冲液将20mmol咪唑、40mmol葡萄糖、20mmol醋酸镁、4.0mmolEDTA溶于1L蒸馏水，用醋酸调节PH至6.7；(7)制备显色剂称取氯化硝基四氮唑蓝(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)0.1mg，使用前加蒸馏水至1ml。本专利技术的目的还在于提供巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒在肿瘤检测上的应用，包括以下步骤1)取已配制好的1％琼脂糖凝胶板一片，在离阴极侧1.5cm处覆盖一条2cm宽滤纸条，吸去部分水分，除去滤纸后将一加样孔膜条置于其上，轻按加样孔膜使其与胶板贴紧，避免气泡，然后将5-7μl样品加入孔内，静置5-10分钟，待样品扩散进入胶内，用一条新的吸水纸盖于加样膜孔上，轻轻吸去多余样品，然后除去膜条；2)将胶板放入两侧已加有缓冲液的电泳槽上，加样侧放于阴极侧，二端用四层纱布搭桥，电泳20分钟，电泳条件为每板40mA，电压150V；3)用底物缓冲液溶解底物，待电泳毕，取出凝胶板，将底物均匀施加于胶板上，上面覆盖一张与胶板大小一致的塑料薄膜，置37℃恒温水浴槽内，温育40分钟，或在45℃温育20分钟；4)温育毕，除去覆盖的塑料薄膜，置干燥箱内20分钟烤干，烘干温度低于75℃；5)在荧光光密度计上扫描测定各同工酶区带的百分率，或在340nm紫外灯下直接观察是否出现紫蓝色巨CK、CK-BB或CK-MB的阳性区带。更特别的，本专利技术所述的巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒在用可见光扫描定量时，在完成操作4)以后，将1ml显色剂铺加于凝胶板上，再次覆盖塑料薄膜，室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巨肌酸激酶琼脂糖电泳试剂盒，其中含有琼脂糖凝胶板、Ｔｒｉｓ缓冲液、巴比妥钠－巴比妥电泳缓冲液、底物、底物缓冲液和显色剂，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶板中含有１％的琼脂糖；在每升所述的Ｔｒｉｓ缓冲液中，含有２０ｍｍｏｌＴｒ ｉｓ，１４克蔗糖，５００毫克叠氮钠，４－６ｇＬ－天冬酸干粉；在每升所述的巴比妥钠－巴比妥电泳缓冲液中含有１０．３克巴比妥钠，１．８４克巴比妥；在每升所述的底物中含有４．０ｍｍｏｌＡＤＰ，１０．０ｍｍｏｌＬＡＭＰ，２０μｍｏｌ 二腺苷五磷酸，４．０ｍｍｏｌＮＡＤＰ，６０ｍｍｏｌ酸肌酸钠，≥５．０Ｕ已糖激酶，≥３．０Ｕ６－磷酸葡萄糖脱氢酶，４０ｍｍｏｌＮ－乙酰半胱氨酸；在每升所述的底物缓冲液中含有２０ｍｍｏｌ的咪唑，４０ｍｍｏｌ的葡萄糖，２０ｍｍｏｌ的醋酸镁 ，４．０ｍｍｏｌＥＤＴＡ；每１ｍｌ所述的显色剂中含有氯化硝基四氮唑蓝（ＮＢＴ）２ｍｇ，吩嗪二甲酯硫酸盐（ＰＭＳ）０．１ｍｇ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱华，于嘉屏，许绍辉，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]