免疫调节性小发夹RNA分子制造技术

本发明专利技术总体上涉及具有小发夹结构(shRNA)并且可以与视黄酸诱导型基因I受体(RIG‑I)结合的特异性免疫调节性RNA种类。特别地，所述RNA种类包含核苷酸插入以在茎区中产生扭结。还涵盖了包含此类shRNA的组合物，用作抗病毒或抗癌药物或疫苗中的佐剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫调节性小发夹RNA分子相关申请的交叉引用本申请参考并要求于2018年1月17日提交的新加坡专利申请号10201800434S的优先权利益，根据PCT实施细则4.18出于所有目的将其通过援引以其全文并入本文，包括对未包括在本文内但在PCT实施细则20.5(a)下援引的说明书、权利要求书或附图中任何要素或部分的并入。
本专利技术总体上涉及用于开发激活视黄酸诱导型基因I受体(RIG-I)的有效免疫调节性RNA种类的结构指导RNA设计、由此获得的RNA分子、含有它们的组合物及其用途和使用方法。
技术介绍
对具有新作用机制的免疫调节性分子的公众健康需求日益增加，这些分子可用作抗病毒产品或疫苗佐剂。通过靶向宿主而不是病毒，这样的分子可以有效地阻断广谱的病毒感染。早期和正在进行的药物开发项目大多靶向病原体及其必需的酶。调节宿主对感染的免疫应答的分子靶标在很大程度上被忽略了。靶向宿主分子的一个关键优点是降低了对病毒适应性突变的敏感性。视黄酸诱导型基因I(RIG-I)样受体(RLR)是一类重要的模式识别受体，其在病毒感染过程中感知病毒RNA。RLR由视黄酸诱导型基因1(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和遗传学和生理学实验室蛋白2(LaboratoryofGeneticsandPhysiology2，LGP2)三个成员组成。它们在感知病毒感染和启动干扰素介导的抗病毒免疫应答中起着必不可少的作用。RLR是一类常见的模式识别受体(PRR)，其检测感染的细胞的胞浆中的病毒RNA，并通过产生促炎细胞因子和I型干扰素来触发先天免疫应答。RLR具有通过代表病毒复制特征的某些基序来区分自身和非自身RNA的能力。RIG-I能够检测由病毒产生的RNA，这是因为在复制病毒的RNA链上存在三磷酸化部分，而内源性RNA被进一步加工为包含5'帽子(Hornung等人(2006),Science[科学]314(5801):994-7)。存在于折叠形成柄状结构的ssRNA病毒复制起点中的部分互补末端序列也被RIG-I识别(Schlee等人(2009),Immunity[免疫]31(1):25-34)。此外，RIG-I还识别干扰缺损RNA基因组形成的基于快速恢复的配对结构(Strahle等人(2006),Virology[病毒学]351(1):101-11)。除了5'三磷酸末端RNA，RIG-I还识别和结合5'二磷酸化RNA以及帽0RNA(Devarkar等人(2016)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]113(3):596-601；Goubau等人(2014),Nature[自然]514(7522):372-5)。RLR的核心是一种特异性的DExD/H-盒RNA解旋酶(由Hel1、Hel2和插入结构域Hel2i组成)，以识别双链RNA主链。C末端结构域(CTD)是含有Zn2+的RNA结合结构域。HEL-CTD一起形成RNA感知模块，负责检测捕获的RNA种类的化学和结构特征，以便确定是否允许RLR激活(Kohlway等人(2013),EMBORep[欧洲分子生物学会报道]14(9):772-9；Luo等人(2011),Cell[细胞]147(2):409-22；Schlee(2013),Immunobiology[免疫生物学]218:1322-1335)。RIG-I和MDA5的N末端串联半胱天冬酶激活和募集结构域(CARD)是信号传导结构域，其负责通过与线粒体外膜上的衔接蛋白MAVS(线粒体抗病毒信号传导蛋白)相互作用并使其寡聚体化来激活下游信号传导(Kawai等人(2005),NatImmunol[自然免疫学]6:981-988；Meylan等人(2005)Nature[自然]437:1167-1172；Peisley等人(2014)Nature[自然]509:110-114；Seth等人(2005)Cell[细胞]122:669-682；Wu等人(2014),MolCell[分子细胞]55:511-523；Xu等人(2005)MolCell[分子细胞]19:727-740)。RIG-I和MDA5识别不同但重叠的RNA病毒亚群。这与它们的RNA识别偏好有关。尽管RIG-I偏好具有5’末端三磷酸的短双链体RNA，但MDA5协同地结合长双链体RNA而对5’末端的特征末端的RNA偏好没有要求(Kato等人(2006),Nature[自然]441:101-105；Loo&Gale(2011),Immunity[免疫]34:680-692；Wu&Chen(2014),AnnuRevImmunol[免疫学年度综述]32:461-488；Zheng等人(2015),NucleicAcidsRes[核酸研究]43:1216-1230；Kowalinski等人(2011),Cell[细胞]147:423-435；Luo等人(2011),Cell[细胞]147:409-422,Wu等人(2013),Cell[细胞]152:276-289)。在细胞质中，RIG-I以自抑制构象存在，其中CARD在细胞正常状态期间与HEL2i结构域相互作用(Kowalinski等人，同上；Zheng等人，同上)。当病毒感染后，它遇到病原RNA时，蛋白质发生构象重排并发生ATP水解。结果，N末端CARD将被暴露以允许与MAVS相互作用(Wu&Chen等人，同上；Wu等人，同上)。随后，MAVS将经由IRF3、IRF7和NFκB转录因子激活下游信号传导，以触发I型干扰素(IFN-I)和促炎细胞因子的产生(Seth等人,同上；Peisley等人,同上；Hiscott等人(2006),TrendsMolMed[分子医学趋势]12:53-56；Iwanaszko&Kimmel(2015),BMCgenomics[BMC基因组学]16:307；Ramos&Gale(2011),CurrOpinVirol[病毒学当前观点]1:167-176)。RIG-I的CTD识别病毒复制过程中通常产生的5'三磷酸化RNA并被其激活(Hornung等人(2006),Science[科学]314:994-997)。除了5’三磷酸化RNA外，RIG-I还将末端5’二磷酸和帽0部分识别为非自身RNA(Devarkar等人(2016)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]113(3):596-601；Goubau等人(2014),Nature[自然]514(7522):372-5)。最近的研究显示，RIG-I对聚U/UC段和富AU的RNA有更高的偏好(Runge等人(2014),PLoSpathogens[公共科学图书馆―病原体]10:e1004081；Schnell等人(2012),PLoSPathog[公共科学图书馆―病原体]8:e1002839)。此外，最小长度为10-12个碱基对的短RNA发夹能够结合并激活RIG-I(Kohlway等人，同上；Zheng等人，同上)。也有报道短RNA双链体以细胞类型和长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小发夹RNA(shRNA)分子，其以5’至3’方向具有以下结构，/nX

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180117 SG 10201800434S1.一种小发夹RNA(shRNA)分子，其以5’至3’方向具有以下结构，
X1-L-X2，
其中，
X1和X2各是长度为8至30个核苷酸的核苷酸序列，彼此具有足够的互补性以形成双链茎结构；
L是形成环区的核苷酸序列；
位于X1的5'末端的第一个核苷酸被命名为n1并且被二磷酸化或三磷酸化，并且X2的3'末端的最后一个核苷酸被命名为nx，其中x是25至65的整数；
所述shRNA分子包含在X1中位置n7或更高位置或X2中位置nx-6或更低位置的核苷酸插入，所述核苷酸插入在所述双链茎结构中保持未配对并产生扭结。


2.如权利要求1所述的shRNA分子，其中L是长度为1至10个核苷酸，优选长度为2至4个核苷酸的核苷酸序列。


3.如权利要求1或2所述的shRNA分子，其中5'末端处的所述核苷酸被三磷酸化。


4.如权利要求1至3中任一项所述的shRNA分子，其中所述shRNA分子是平末端的。


5.如权利要求1至4中任一项所述的shRNA分子，其中X1和X2各自是长度10至25个核苷酸，优选长度10、11、20、21、30或31或10-20个核苷酸，更优选长度10或11个核苷酸的核苷酸序列。


6.如权利要求1至5中任一项所述的shRNA分子，其中X1和X2具有相同的长度，不计算产生所述扭结的所述核苷酸插入，并且长度是10、20或30个核苷酸，优选10个核苷酸。


7.如权利要求1至6中任一项所述的shRNA分子，其中X1和X2除了产生所述扭结的所述核苷酸插入之外，彼此完全互补。


8.如权利要求1至7中任一项所述的shRNA分子，其中所述核苷酸插入是1-2个核苷酸的核苷酸插入，优选单核苷酸的核苷酸插入。


9.如权利要求1至8中任一项所述的shRNA分子，其中所述核苷酸插入是X1中的核苷酸插入。


10.如权利要求1至9中任一项所述的shRNA分子，其中所述核苷酸插入是在选自以下位置：范围从n7至X1的倒数第二位置的位置或范围从X2的第二位置至nx-6的位置。


11.如权利要求10所述的shRNA分子，其中所述核苷酸插入是在选自以下的位置：位置范围从n9至所述环区第一个核苷酸上游2或3个核苷酸的位置，或从所述环区最后一个核苷酸下游2或3个核苷酸的位置至nx-8。


12.如权利要求11所述的shRNA分子，其中所述核苷酸插入是在所述X1序列中的位置n9。


13.如权利要求1至12中任一项所述的shRNA分子，其中所述核苷酸插入是嘌呤或嘧啶核苷酸，优选选自G和A的嘌呤核苷酸。


14.如权利要求13所述的shRNA分子，其中所述核苷酸插入是G或A。


15.如权利要求1至14中任一项所述的shRNA分子，其中所述环区L包含序列UUCG或由其组成。


16.如权利要求1至15中任一项所述的shRNA分子，其中X1包含以下或由以下组成：选自由以下群组组成的核苷酸序列：
rrrnnyyyryy(SEQIDNO:1)；
sswwwwssrss(SEQIDNO:2)；
ggannnnnnnn(SEQIDNO:3)；
ggannnnnncc(SEQIDNO:4)；
ggannuncncc(SEQIDNO:5)；
ggawwuscncc(SEQIDNO:6)；
ggauuuccrcc(SEQIDNO:7)；
ggauuuccacc(SEQIDNO:8)；或者
ggauuuccgcc(SEQIDNO:9)，
其中r是g或a，y是u或c，w是a或u，s是g或c，并且n是a、g、u或c，并且其中所述X1序列优选包含插入的未配对核苷酸，所述未配对核苷酸优选是位置9处的核苷酸。


17.如权利要求1至16中任一项所述的shRNA分子，其中X2包含以下或由以下组成：选自由以下群组组成的核苷酸序列：
rrrrrnnyyy(SEQIDNO:10)；
sssswwwwss(SEQIDNO:11)；
nnnnnnnucc(SEQIDNO:12)；
ggnnnnnucc(SEQIDNO:13)；
gggnannucc(SEQIDNO:14)；
g...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗大海，芬克·卡特娅，杨徽仪，何进勇，
申请(专利权)人：南洋理工大学，新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG