肝素和硫酸乙酰肝素寡糖制造技术

公开了能够结合BMP2的链长为至少10个糖且不超过50个糖的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖片段。还公开了相同的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖片段在试剂盒和药物组合物中的用途，以及相同的硫酸乙酰肝素寡糖片段在结缔组织和骨骼的修复和/或再生以及伤口治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝素和硫酸乙酰肝素寡糖专利
本专利技术涉及肝素和硫酸乙酰肝素寡糖，包括具有确定的链长的肝素型或硫酸乙酰肝素型寡糖，并且特别地但非排他地，涉及结合BMP2的此类寡糖。
技术介绍
骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一大类，它们在包括中胚层形成、神经模式、骨骼发育和肢体形成的各种过程中起着至关重要的作用(1、2)。已经鉴定出超过15个BMP成员，它们在受伤后的组织修复和重塑过程中起着重要作用(3-7)。在动物模型中，有几种重组BMP被报道诱导异位骨形成并增强关键尺寸节段性骨缺损的愈合。临床研究表明，重组人BMP的使用是自体骨移植的安全有效替代方法。重组BMP2和BMP-7分别被批准用于人类的脊柱融合术和顽固的长骨不愈合(4-7)。在细胞水平，BMP信号传导是通过结合两种类型的特定跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，即I型(BMPR-I)和II型(BMPR-II)受体而启动的(8)。已经显示，BMP2信号传导是由于与预聚集的受体复合物结合，而不是与细胞膜中的游离受体结合所致(9)。配体结合后，I型受体被配体结合的II型受体激活。然后，活化的I型受体使细胞内蛋白Smad家族的成员Smad1、Smad5和Smad8磷酸化，后者又与Smad4组装成异源复合物，并转移到细胞核中以调节靶基因的转录(10-12)。据报道，BMP的体内和体外生物学活性受到大量细胞外和细胞表面硫酸化多糖(例如肝素和硫酸乙酰肝素(HS))的正负调节(8,13-20)。BMP2将C2C12成肌细胞的分化途径转化为成骨细胞谱系，肝素在体外增强了C2C12成肌细胞中BMP2诱导的成骨细胞分化(20-22)。与其他蛋白质一样，据信肝素/硫酸乙酰肝素链中的特定大小和硫酸化残基与BMP2结合，从而调节这些分子的受体介导的信号传导。多年来，已鉴定出数百种HS结合蛋白，但是HS如何与这些蛋白相互作用并影响其稳定性、浓度、构象和活性是生物学中的一个基本问题。多项研究表明，生长因子与HS的结合并因此导致有丝分裂活性仅在HS链中存在特定结构特征时才会发生(23)。这些特征包括二糖内特定位置的硫酸化；6-O硫酸化N-硫酸葡糖胺和2-O硫酸化的艾杜糖醛酸残基特别重要，最小结合序列的长度通常至少为5-6个二糖(24-26)。这些相互作用中涉及的HS的精确结构仍然难以捉摸。HS上最小结合序列的信息对于理解HS-蛋白质相互作用的规则和可靶向人类疾病中蛋白质的HS模拟物的设计至关重要。肝素/HS基序的最小长度和结构特征仅在少数情况下被鉴定(27-30)。关于配体结合和活性所需的HS基序最小长度的第一个充分研究的实例是肝素衍生的五糖足以与抗凝血酶III相互作用以抑制凝血因子凝血酶(IIa)和凝血因子Xa(28-30)。但是，肝素衍生的四糖足以与成纤维细胞生长因子2(FGF-2)相互作用，但是需要聚合度(dp)为10-12的寡糖来优化FGF-2的增殖活性。然而，抗凝血酶III结合所需的结构序列，其最大特征是6-O硫酸盐N-磺基葡糖胺残基上的异常3-O硫酸盐基团(31)。此外，可以结合FGF-2的HS模式的结构特征表明，连续延长二硫化物二糖N-磺基葡萄糖胺-艾杜糖醛酸2-O硫酸盐对于获得最高结合能力非常重要(32)。这些实施例清楚地表明，或结合或生物学活性所需的最小寡糖长度单位和HS模式的特定结构特征并不严格相关。在这种情况下，最小HS单元和结合BMP2的HS的特定硫酸盐基团的表征对于试图阐明强化HS在BMP2活性调节需求的分子机制非常重要。但是，HS的序列和大小极为不同，来源也很有限。肝素的结构类似于HS的硫酸化区域。因此，在这项研究中，我们研究了肝素衍生寡糖的特定硫酸根基团与最小长度之间的关系(这是结合BMP2所必需的)及其增强C2C12成肌细胞上BMP2诱导的成骨细胞分化的能力。以前，我们鉴定并分离了以高亲和力结合BMP2的硫酸乙酰肝素，并证明该HS在骨骼的修复/再生中具有活性。我们的工作在WO2010/030244A1和US9498494中有所报道。专利技术概述在本专利技术的一方面，提供了分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖具有至少6个糖且不超过50个糖的链长。其他方面和实施方式在所附权利要求中描述。在一些实施方式中，寡糖的链长为以下之一：至少8、至少10或至少12个糖。在一些优选的实施方式中，寡糖包含8、10或12个糖的链长，或由8、10或12个糖的链长组成。在一些实施方式中，寡糖的链长不超过以下之一：49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、32、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个糖。在一些实施方式中，寡糖的链长为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个糖之一。在一些实施方式中，所述的寡糖是N-硫酸化的。这可以包括肝素或硫酸乙酰肝素寡糖链中的N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)残基的N-硫酸化。优选地，分离的肝素或硫酸乙酰肝素中的至少80％的N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)残基是N-硫酸化的。在一些实施例中，可以是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。在一些实施方式中，寡糖是6-O硫酸化(N-磺基葡糖胺(GlcNS)残基在C6处的O-硫酸化)。优选地，肝素或硫酸乙酰肝素寡糖链中的至少80％的N-磺基葡糖胺(GlcNS)残基是6-O-硫酸化的。在一些实施方式中，可以是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。尽管寡糖可以不同程度地2-O硫酸化(在IdoA和GlcA的C2处O-硫酸化)，但在某些实施方式中，分离的肝素或硫酸乙酰肝素是2-O脱硫酸化的。在一些实施方式中，寡糖结合BMP2蛋白，任选地具有小于以下之一的KD：100mM、50mM、10mM、1mM、100nM、50nM、10nM、或1nM。提供了包含分离的肝素或硫酸乙酰肝素的制剂或组合物。在本专利技术的一个方面，提供了一种药物组合物或药物，其包含如上述方面的分离的肝素或硫酸乙酰肝素。所述的药物组合物或药物可进一步包含药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂。在本专利技术的另一方面，提供了一种组合物，其包含根据上述方面中任一项的分离的肝素或硫酸乙酰肝素和BMP2蛋白。在本专利技术的一方面，提供了分离的肝素或硫酸乙酰肝素用于治疗方法。在本专利技术的相关方面，提供了分离的肝素或硫酸乙酰肝素在制备用于治疗方法的药物中的用途。在本专利技术的另一方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括将分离的肝素或硫酸乙酰肝素给予需要治疗的受试者的步骤。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，链长为至少10个糖且不超过50个糖，其中所述寡糖能够结合BMP2。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171211 SG 10201710287Y1.一种分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，链长为至少10个糖且不超过50个糖，其中所述寡糖能够结合BMP2。


2.如权利要求1所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素的链长为至少12个糖。


3.如权利要求1所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素包含约10或约12个糖的链长或由其组成。


4.如权利要求1所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素包含10至50个糖的链长或由其组成，任选地12至50个糖、14至50个糖、16至50个糖、18至50个糖、20至50个糖、22至50个糖、24至50个糖、26至50个糖、28至50个糖、30至50个糖、32至50个糖、34至50个糖、36至50个糖、38至50个糖、40至50个糖、42至50个糖、44至50个糖、46至50个糖或48至50个糖之一。


5.如权利要求1所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素包含10至36个糖的链长或由其组成，任选地12至36个糖、14至36个糖、16至36个糖、18至36个糖、20至36个糖、22至36个糖、24至36个糖、26至36个糖、28至36个糖、30至36个糖、32至36个糖或34至36个糖之一。


6.如权利要求1所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素包含36至50个糖的链长或由其组成，任选地38至50个糖、40至50个糖、42至50个糖、44至50个糖、46至50个糖、或48至50个糖之一。


7.如权利要求1所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素包含18至40个糖的链长或由其组成，任选地20至40个糖、22至40个糖、24至40个糖、26至40个糖、28至40个糖、30至40个糖、32至40个糖、34至40个糖、36至40个糖或38至40个糖之一。


8.如权利要求1至7中任一项所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素增强BMP2介导的ALP活性，例如在BMP2介导的ALP活性的体外测定中所测量的。


9.如权利要求1至8中任一项所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素增强BMP2介导的Smad1/5/9磷酸化，例如在BMP2介导的Smad1/5/9磷酸化的体外测定中所测量的。


10.如权利要求1至9中任一项所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素是N-硫酸化的。


11.如权利要求1至10中任一项所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素是6-O硫酸化的。


12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖，其中所述分离的肝素或硫酸乙酰肝素是2-O脱硫酸化的。


13.如权利要求1至12中任一项所述的分离的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖的混合物。


14.一种混合物，其包含或由多个结合BMP2的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖组成，所述的各个肝素或硫酸乙酰肝素寡糖的链长为至少10个糖且不超过50个糖。


15.如权利要求14所述的混合物，其中所述混合物以分离的或基本纯的形式提供。


16.如权利要求14或15所述的混合物，其中所述寡糖各自具有至少12个糖的链长。


17.如权利要求14或15所述的混合物，其中所述寡糖各自具有约10或约12个糖的链长。


18.如权利要求14至17中任一项所述的混合物，其中所述寡糖各自具有10至50个糖的链长，任选地12至50个糖、14至50个糖、16至50个糖、18至50个糖、20至50个糖、22至50个糖、24至50个糖、26至50个糖、28至50个糖、30至50个糖、32至50个糖、34至50个糖、36至50个糖、38至50个糖、40至50个糖、42至50个糖、44至50个糖、46至50个糖或48至50个糖之一。


19.如权利要求14至17中任一项所述的混合物，其中所述寡糖各自具有10至36个糖的链长，任选地为12至36个糖、14至36个糖、16至36个糖、18至36个糖、20至36个糖、22至36个糖、24至36个糖、26至36个糖、28至36个糖、30至36个糖、32至36个糖或34至36个糖之一。


20.如权利要求14至17中任一项所述的混合物，其中所述寡糖各自具有36至50个糖的链长，任选地为38至50个糖、40至50个糖、42至50个糖、44至50个糖、46至50个糖或48至50个糖之一。


21.如权利要求14至17中任一项所述的混合物，其中所述寡糖各自具有18至40个糖的链长，任选地20至40个糖、22至40个糖、24至40个糖、26至40个糖、28至40个糖、30至40个糖、32至40个糖、34至40个糖、36至40个糖或38至40个糖之一。


22.如权利要求14至21中任一项所述的混合物，其中所述结合BMP2的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖增强BMP2介导的ALP活性，例如在BMP2介导的ALP活性的体外测定中所测量的。


23.如权利要求14至22中任一项所述的混合物，其中所述结合BMP2的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖增强BMP2介导的Smad1/5/9磷酸化，例如在BMP2介导的Smad1/5/9磷酸化的体外测定中所测量的。


24.如权利要求14至23中任一项所述的混合物，其中所述结合BMP2的肝素或硫酸乙酰肝素寡糖是N-硫酸化的。


25.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·A·A·史密斯，S·M·库尔，V·纳康比，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG