一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法及丁酸梭菌计数方法技术

本发明专利技术属于微生物培养技术领域，具体涉及一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法及丁酸梭菌计数方法。该培养方法包括以下步骤：在培养容器中将液态的丁酸梭菌培养基与样品液混匀，静置凝固后，在凝固面的上表面覆盖一层阻隔剂，静置凝固以隔绝空气，然后恒温培养。使用本发明专利技术的培养方法进行丁酸梭菌计数时，通过在普通的丁酸梭菌培养基上添加一层阻隔剂，使得将培养皿放置在普通环境中培养即可实现为丁酸梭菌的生长提供无氧环境的目的，避免使用厌氧培养箱，使培养过程更易控制，方便、快捷，并且计数结果准确，方便生产者和消费者的计数检测，能够改善丁酸梭菌制剂的市场环境。

【技术实现步骤摘要】
一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法及丁酸梭菌计数方法
本专利技术属于微生物培养
，具体涉及一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法及丁酸梭菌计数方法。
技术介绍
丁酸梭菌作为新一代芽孢益生菌，能促进双歧杆菌、乳酸菌等肠道有益菌的生长繁殖，具有抑制肠出血性大肠埃希菌、痢疾志贺菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌等肠道致病菌的生长繁殖，抑制艰难梭菌生长繁殖，加强肠道黏膜营养代谢、保护受损的黏膜屏障，激活免疫细胞、改善并恢复肠道正常免疫力，防治肿瘤生长等的作用。丁酸梭菌制剂与非芽孢类微生态制剂相比，其对胃酸和温度有更好的耐受性，利于常温保存，便于携带和服用，而且能和某些抗生素联合使用。因此丁酸梭菌制剂具有广泛的应用前景和研究价值。微生态制剂在实际应用过程中影响其效果的因素包括：(1)有效活菌数，针对不同养殖动物及不同饲用阶段，丁酸梭菌添加量不同；丁酸梭菌的作用功效与其有效活菌数密切相关，如果数量不足，在肠道内无法形成优势菌群，就难以发挥益生作用。要获得最佳饲用效果，饲料中丁酸梭菌需达到一定数量；(2)动物生理条件，动物年龄及健康状况会直接影响丁酸梭菌添加剂的使用效果；(3)添加时间及使用方式，丁酸梭菌的添加时间和使用方式不同，效果也不同。有效活菌数是研究微生态制剂过程中首要关心的因素，因此如何规范检测微生态制剂中有效活菌数也是必须解决的问题之一。基于目前丁酸梭菌有效活菌数的检测没有国家标准的情况，各地方企业根据自己的实际情况制定了适合自己的丁酸梭菌检测企业标准，例如河南金百合生物科技股份有限公司企业标准Q/HJBH007-2019中使用的稀释计数法的检测过程包括：样品梯度稀释、接种、厌氧培养、活菌数计算等步骤。该计数方法适用于丁酸梭菌发酵液和饲料添加剂中丁酸梭菌活菌数的检测。丁酸梭菌因其严格厌氧的特性，对活菌数检测环境的要求也更为严苛，通常来讲，需要使用厌氧培养箱对其进行培养、检测，而厌氧培养箱在使用前需要繁琐的气体置换以及除氧剂的添加等处理过程，在使用过程中还需要实时检测厌氧环境是否满足要求、及时更换除氧剂等，并且，对于厌氧培养箱，箱内温度较难控制均匀，一般需要较长的培养时间。企业生产的丁酸梭菌制剂产品流向全国各地的消费者，鉴于目前计数方法所要求的厌氧环境的获取相对较为复杂，丁酸梭菌的计数很难顺利进行，从而影响丁酸梭菌制剂市场的占有率。因此，需要建立一种准确、便捷的丁酸梭菌计数方法以改善丁酸梭菌制剂的市场环境。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法，降低对培养设备的要求、简化培养阶段的操作步骤、便于准确计数检测。本专利技术的另一个目的是提供一种丁酸梭菌计数方法，以准确、便捷地对丁酸梭菌制剂中的活菌进行计数。为实现上述目的，本专利技术的用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法的具体技术方案为：一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法，包括以下步骤：在培养容器中将液态的丁酸梭菌培养基与样品液混匀，静置凝固后，在凝固面的上表面覆盖一层阻隔剂，静置凝固以隔绝空气，然后恒温培养。本专利技术的用于丁酸梭菌计数的培养方法，通过在普通的丁酸梭菌培养基上添加一层阻隔剂，使得将培养容器放置在普通有氧环境中培养即可实现为丁酸梭菌的生长提供无氧环境的目的，避免使用厌氧培养箱，简化培养阶段的操作过程并且培养温度容易控制，方便、快捷，并且计数结果与现有方法所得结果一致，具有较高的准确度，方便生产者和消费者对丁酸梭菌制剂中活菌数的测定，能够帮助改善丁酸梭菌制剂的市场环境。可以理解的是，培养容器可以是培养皿、敞口培养瓶等；液态的丁酸梭菌培养基在培养温度以下可以凝固，使用时其温度高于凝固温度，呈液态。可以理解的是，由于丁酸梭菌产品(包括丁酸梭菌发酵液和菌粉制剂)中活菌数较大，对其计数时，需要进行一定程度的稀释从而得到样品液，保证最终培养形成的菌落能够清楚识别。丁酸梭菌培养基的加入量太少会导致形成的菌落中间有黑点、周围有晕圈，影响计数，加入量太多则造成不必要的浪费，优选的，所述样品液由丁酸梭菌发酵液稀释得到，每25mL的丁酸梭菌发酵液对应20-30mL的丁酸梭菌培养基，优选的，每25mL的丁酸梭菌发酵液对应20-25mL的丁酸梭菌培养基；或者，所述样品液由丁酸梭菌菌粉稀释得到，每25g的丁酸梭菌菌粉对应20-30mL的丁酸梭菌培养基，优选的，每25g的丁酸梭菌菌粉对应20-25mL的丁酸梭菌培养基。进一步的，阻隔剂的加入量以能够隔绝空气为基本要求，为避免加入量过大造成不必要的浪费，优选的，所述阻隔剂的厚度为5-7mm。因丁酸梭菌在生长过程中会产气，而且培养时间过久会出现大片黑色晕染，所以培养时间对计数时观察效果影响比较大，优选的，所述恒温培养的时间为14-17h，进一步优选的，所述恒温培养的时间为14-15h。现有技术方法中使用的厌氧培养箱，其温度难以控制均匀，培养时间相对较长，一般为16-18h，本专利技术的培养方法能够将培养时间缩短，提高计数检测的效率。阻隔剂可以选择能够用于微生物培养的物质，可以直接以丁酸梭菌培养基作为阻隔剂，但成本较高，可以选择琼脂等。进一步的，所述丁酸梭菌培养基为能够为丁酸梭菌生长提供基本营养物质的培养基，一般的，可选用丁酸梭菌培养、计数时常用的亚硫酸铁琼脂培养基。本专利技术的丁酸梭菌计数方法的具体技术方案为：一种丁酸梭菌计数方法，利用稀释计数法进行计数，包括以下步骤：A.将样品制成样品稀释液；B.采用前述的用于丁酸梭菌计数的培养方法对样品稀释液进行培养；C.确定每个稀释度的样品稀释液对应的活菌数，计算即得样品中的活菌数。本专利技术的丁酸梭菌计数方法，采用新型的丁酸梭菌培养方法对稀释后丁酸梭菌制剂样品进行培养，避免使用厌氧培养箱，使培养过程简单、易控，计数检测过程方便、快捷，并且计数结果与现有方法所得结果一致，具有较高的准确度，并且能够提高计数检测的效率，方便生产者和消费者对丁酸梭菌制剂中活菌数的测定，能够帮助改善丁酸梭菌制剂的市场环境。可以理解的是，为了使检测结果更加准确，对于每个稀释度的样品稀释液，在进行培养时设置平行实验，一般的，可设置3个平行。对于不同类型的丁酸梭菌制剂产品，比如丁酸梭菌发酵液(活菌数数量级为108)或者丁酸梭菌菌粉(活菌数数量级为109、1010)，根据产品标示活菌数的不同，选择合适稀释度的样品稀释液进行培养，以保证最终培养容器中的菌落数在适宜计数的范围内，一般的，以菌落数在30-300为宜，步骤A中所述样品稀释液的稀释度为1:105、1:106、1:107、1:108、1:109中的至少1个。具体实施方式下面结合具体实施例具体说明本专利技术所述方法的应用。特别需要指出的是，本专利技术说明书所举实施例只是为了帮助理解本专利技术，它们不具任何限制作用，即本专利技术除说明书所举实施例外，还可以有其他实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案，均落在本专利技术要求的保护范围中。一、本专利技术的用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法的具体实施例...

【技术保护点】
1.一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法，其特征在于，包括以下步骤：在培养容器中将液态的丁酸梭菌培养基与样品液混匀，静置凝固后，在凝固面的上表面覆盖一层阻隔剂，静置凝固以隔绝空气，然后恒温培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于活菌计数的丁酸梭菌培养方法，其特征在于，包括以下步骤：在培养容器中将液态的丁酸梭菌培养基与样品液混匀，静置凝固后，在凝固面的上表面覆盖一层阻隔剂，静置凝固以隔绝空气，然后恒温培养。


2.根据权利要求1所述的活菌计数的丁酸梭菌培养方法，其特征在于，所述样品液由丁酸梭菌发酵液稀释得到，每25mL的丁酸梭菌发酵液对应20-30mL的丁酸梭菌培养基；或者，所述样品液由丁酸梭菌菌粉稀释得到，每25g的丁酸梭菌菌粉对应20-30mL的丁酸梭菌培养基。


3.根据权利要求1所述的活菌计数的丁酸梭菌培养方法，其特征在于，所述阻隔剂的厚度为5-7mm。


4.根据权利要求1所述的活菌计数的丁酸梭菌培养方法，其特征在于，所述恒温培养的时间为14-15h。
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【专利技术属性】
技术研发人员：冯利菲，李克克，韩亚坤，李光华，刘会娟，谢璐璐，朱广跃，买超梁，
申请(专利权)人：河南金百合生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41