本发明专利技术涉及一种岩藻糖苷酶活性的测定方法及岩藻糖苷酶诊断试剂盒，运用岩藻糖苷酶酶促反应连续监测法，岩藻糖苷酶酶解岩藻糖苷释放岩藻糖，通过岩藻糖脱氢酶的作用产生还原型辅酶，为了增加反应灵敏度，还原型辅酶在黄递酶作用下还原双偶氮盐发生显色反应，从而检测还原型双偶氮盐在主波长４１０～３６６ｎｍ吸光度上升的速度，进而可以测算岩藻糖苷酶活性的大小。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明专利技术完全可以通过可见光分析仪或半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域内对岩藻糖苷酶活性的检测，尤其涉及利用酶比色法及酶(偶)联法测定岩藻糖苷酶活性的方法，以及由此制得的岩藻糖苷酶诊断试剂盒，属于岩藻糖苷酶活性分析检测
技术介绍
1980年法国学者Deugnier等研究发现，原发性肝癌患者血清岩藻糖苷酶升高，并被众多的研究所证实。故有人提出岩藻糖苷酶可作为原发性肝癌的肿瘤标志物，与甲胎蛋白联合或参照应用大大提高了诊疗价值。近年来研究发现，岩藻糖苷酶对某些疾病的发生、发展均具有重要意义。血清岩藻糖苷酶测定主要有荧光法和比色法。比色法以4-硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷或4-硝基苯α-L-岩藻糖苷为底物显色，在一定程度上被应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种测定岩藻糖苷酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的岩藻糖苷酶诊断试剂盒。为实现本专利技术的目的，一种利用酶比色法及酶(偶)联法测定岩藻糖苷酶活性的方法，采用以下步骤进行首先，将待测样品与含有岩藻糖苷、岩藻糖脱氢酶、双偶氮盐、黄递酶和辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应 然后，将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测还原型双偶氮盐在主波长410～366nm吸光度上升的速度，测算出岩藻糖苷酶的活性大小。上述测定岩藻糖苷酶活性的方法中，所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。实现本专利技术岩藻糖苷酶诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液20～500mmol/L，稳定剂5～100g/ml，岩藻糖脱氢酶 200～500000U/L，黄递酶200～500000U/L，岩藻糖苷 2～30mmol/L，辅酶 0.5～9.0mmol/L，双偶氮盐 0.2～2mmol/L。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分辅酶、岩藻糖苷、双偶氮盐等，可以放在试剂II；试剂II中的岩藻糖脱氢酶、黄递酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将试剂配成如下三试剂 与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的双偶氮盐可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的岩藻糖脱氢酶、黄递酶、岩藻糖苷也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定岩藻糖苷酶活性的方法，其辅酶为氧化型辅酶，是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。双偶氮盐可以是下列底物中之任何一种Neotetrazolium Chloride NT2，2′，5，5′-Tetraphenyl-3，3′-ditetrazolium chloridep-Iodonitrotetrazolium Violet INT2--3--5-phenyltetrazolium chlorideTetranitro-Blue tetrazolium TNBT2，2′，5，5′-Tetra-p-nitrophenyl-3，3′-ditetrazoliumchlorideThiocarbamyl Nitro Blue Tetrazolium TC-NBT2，2′-Di-5，5′-di-3，3′--ditetrazolium chlorideTriphenyltetrazolium Chloride TTC2，3，5-Triphenyltetrazolium chlorideTetrazolium Hydroxide XTT2，3-bis-(2-methoxy4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilideTetrazolium Violet TV2，5-Diphenyl-3--tetrazolium chlorideThiazolyl Blue MTT3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H tetrazolium bromideTetrazolium BlueBT3，3′--bisdichloride)Nitro Blue Tetrazolium NBT2，2′-Di-p-nitrophenyl-5，5′-diphenyl-3，3′--ditetrazolium chlorideMTS tetrazolium MTS(3--5--2--2H-tetrazolium，inner salt) Water-Soluble Tetrazolium WST-1 WST-12-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumWater-Soluble Tetrazolium WST-3 WST-32-(4-Iodophenyl)-3-(2，4-dinitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumWater-Soluble Tetrazolium WST-8 WST-82-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2HtetrazoliumNitrotetrazolium Violet NTV3 alpha-naphthyl-2-phenyl-5-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazolium chlorideCyanoditolyl Tetrazolium ChlorideCTC5-cyano-2，3-ditoyl tetrazolium chloride此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v范围之内。用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本专利技术的优选方案缓冲液100mmol/L，稳定剂2mol/L，岩藻糖脱氢酶 8000U/L，黄递酶20000U/L，岩藻糖苷 5mmol/L，辅酶 3mmol/L， 双偶氮盐0.5mmol/L。利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测410～366nm波长处吸光度的变化，得以测定岩藻糖苷酶活性的方法。同时，本专利技术还给出用以本文档来自技高网...
【技术保护点】
岩藻糖苷酶活性的测定方法，包括以下步骤：①将待测样品与含有岩藻糖苷、岩藻糖脱氢酶、双偶氮盐、黄递酶和辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，岩藻糖苷＊＊＊岩藻糖＋相应醇类岩藻糖＋辅酶＊＊＊岩藻酮糖＋还原型辅酶双偶氮 盐＋还原型辅酶＊＊＊甲臢＋辅酶②将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测还原型双偶氮盐在主波长４１０～３６６ｎｍ吸光度上升的速度，测算出岩藻糖苷酶的活性大小。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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