一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法及所得复合交联物和应用技术

本发明专利技术公开了一种透明质酸与ε‑聚赖氨酸交联的方法及所得复合交联物和应用，该方法是将透明质酸或其盐和ε‑聚赖氨酸或其盐在耦合剂、辅助耦合剂及中性或碱性水环境下进行交联反应，得到复合交联物。本发明专利技术在中性或碱性环境下抑制ε‑聚赖氨酸或其盐的质子化，使透明质酸或其盐的羧基与ε‑聚赖氨酸或其盐的氨基发生酰胺化反应，抑制或避免絮凝沉降。本发明专利技术透明质酸或其盐与ε‑聚赖氨酸或其盐交联，ε‑聚赖氨酸或其盐相当于交联剂，ε‑聚赖氨酸或其盐在体内的分解代谢产物可以被人体吸收利用，生物相容性好，可避免传统交联剂易引起的细胞毒性。

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法及所得复合交联物和应用
本专利技术涉及一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，尤其涉及一种透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物的制备方法及所得产品和应用。
技术介绍
透明质酸是一种天然存在的聚阴离子黏多糖，是由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖组成的二糖单元重复构成的直链高分子聚合物。透明质酸广泛存在于生物体内，具备优良的生物相容性，因此它是一种理想的天然高分子医用材料。但透明质酸容易被人体内的酶降解，导致其在体内半衰期不长。为了延长透明质酸在体内停留时间，人们对透明质酸进行了大量的修饰和交联。ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种微生物发酵产生的赖氨酸同聚物，由25-30个赖氨酸聚合而成。它在生物体内生物相容性好，其降解产物是赖氨酸，为人体必需氨基酸，可参与人体的新陈代谢，最终生成二氧化碳和水排出体外。ε-聚赖氨酸是一种对人体安全无毒的聚阳离子多肽，能够抑制革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性菌、真菌等，甚至是某些病毒，抑菌谱广泛，已被广泛用作食品防腐剂。透明质酸和ε-聚赖氨酸虽然都具有良好的生物相容性，但因两者为带相反电荷的高分子聚合物，两者同时存在于生理pH环境时，会形成不溶性的离子络合物。为了使透明质酸和ε-聚赖氨酸之间发生交联反应形成水凝胶而非絮凝沉降，CN108904875A公开了一种促进慢性创面愈合的抗菌自愈合水凝胶辅料及其制备方法和应用，该专利中先用强氧化剂将透明质酸、海藻酸钠或普鲁兰多糖等氧化成含有醛基的多糖，形成的醛基再与ε-聚赖氨酸、聚乙烯亚氨、壳聚糖季铵盐等阳离子聚合物中的氨基或胺基通过席夫碱反应生成一种含亚胺的具有网络结构的聚合物。在该制备方法中，透明质酸首先需要在强氧化剂的作用下被氧化成醛基，然后加入反应终止剂终止氧化反应，再经透析除去强氧化剂与反应终止剂，最后在pH7.4的PBS缓冲液条件下向纯化的氧化多糖中加入阳离子聚合物进行交联反应，制备过程相对复杂。透明质酸在被强氧化剂氧化成含醛基多糖的同时，也会被氧化降解，透明质酸长链及分子结构会遭到一定程度的破坏。
技术实现思路
针对透明质酸与ε-聚赖氨酸因自身性能交联反应容易形成絮凝沉降的不足，本专利技术提供了一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，还可以称为防止或降低透明质酸与ε-聚赖氨酸絮凝沉降的方法或调控透明质酸与ε-聚赖氨酸交联程度的方法，该方法不仅可以解除阴、阳离子聚合物发生络合的配伍禁忌，在交联过程中降低絮凝沉降的产生量或不产生絮凝沉降，还能直接使透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸中自身含有的羧基和氨基官能团进行交联，操作简便易行，不会破坏透明质酸或其盐的长链及分子结构。研究发现，在酸性环境下，ε-聚赖氨酸的游离羟基会发生质子化而带正电荷，同时失去亲核力。此时，ε-聚赖氨酸会优先与透明质酸发生离子络合反应，形成絮凝沉降，无法形成透明的交联凝胶。而在中性或碱性环境下，将透明质酸或其盐加入含有ε-聚赖氨酸或其盐的溶液中进行反应，透明质酸或其盐的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐的氨基会优先发生酰胺化反应，形成透明的交联复合凝胶，不发生絮凝，反应步骤简单，副反应发生的几率也小。基于上述研究发现，本专利技术提供了一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，该方法包括透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸或其盐在耦合剂、辅助耦合剂及中性或碱性水环境下进行交联反应的步骤。进一步的，上述方法中，ε-聚赖氨酸或其盐和透明质酸或其盐可以以固体的形式加入，也可以以溶液的形式加入。优选的，先将ε-聚赖氨酸或其盐、耦合剂和辅助耦合剂在中性或碱性水环境中混合，然后再加入透明质酸或其盐，这样可以使ε-聚赖氨酸或其盐与透明质酸或其盐混合更加均匀，更能避免絮凝沉降的产生。当然，也可以采用先加透明质酸或其盐，再加ε-聚赖氨酸或其盐的方式，但这种加料方式容易造成原料混合不均匀，为了使原料混合均匀一般ε-聚赖氨酸或其盐需要采用缓慢滴加的方式，以避免絮凝的产生，但是这种加入方式操作繁琐、缓慢、效率低。进一步的，上述方法优选包括以下步骤：（1）将耦合剂、辅助耦合剂、ε-聚赖氨酸或其盐和水混合均匀；（2）将上述溶液pH调至中性或碱性，再向其中加入透明质酸或其盐进行交联反应，得交联的复合凝胶；（3）将上述交联的复合凝胶去除杂质、干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。本专利技术在中性或碱性条件下先将耦合剂/辅助耦合剂和ε-聚赖氨酸或其盐混合，随后加入透明质酸或其盐进行反应，简洁、高效的实现了透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸或其盐的交联，避免了这两者接触时形成絮凝沉降，反应步骤简单，副反应小。反应所用的耦合剂为碳二亚胺类物质，所述碳二亚胺类物质是现有技术中报道的可以用于透明质酸交联的含碳二亚胺结构的物质，例如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺及其盐等，1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐可以是其盐酸盐或者其他可行的盐。在使用时，碳二亚胺类物质既可以是一种，也可以是多种的混合。反应所用的辅助耦合剂为琥珀酰亚胺类物质，所述琥珀酰亚胺类物质包括N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）中的一种或多种。通过耦合剂和辅助耦合剂的联用，大大提高了交联效率和程度。进一步的，交联反应在中性或碱性环境下进行，该环境有利于避免ε-聚赖氨酸或其盐发生质子化，pH优选为7-12，更优选为8-10。pH可以由酸或碱来调整，所用酸可以是盐酸、硫酸、硝酸等常用无机酸，所用碱可以是碱金属氢氧化物等常用无机碱，优选的，所用碱为氢氧化钠。进一步的，本专利技术所用的透明质酸或其盐原料的分子量没有特别要求，可以根据产品的应用领域、作用等进行选择，例如在用作细胞培养支架材料时，透明质酸或其盐的分子量一般为200KDa~3000KDa。所述透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐、锌盐等可用盐，常用的为钠盐。进一步的，交联反应时，体系中透明质酸或其盐的浓度一般为10g/L~200g/L。在此范围内，原料能较好的溶解，反应体系的粘度也不会太高，能较快的进行反应。当透明质酸或其盐分子量较大时，可以选择较小的浓度，以便于溶解和反应，当透明质酸或其盐分子量较小时，可以选择较大的浓度。进一步的，本专利技术所用的ε-聚赖氨酸盐可以是ε-聚赖氨酸盐酸盐等医学可接受的盐。进一步的，交联反应时，透明质酸或其盐中的羧基、耦合剂和辅助耦合剂的摩尔比为1:0.1-2:0.1-2，优选1:1-2:0.5-2。进一步的，交联反应时，透明质酸或其盐中的羧基与ε-聚赖氨酸或其盐中的氨基的摩尔比为1:0.1-1。在此摩尔比范围内，能够较好的避免絮凝沉淀的产生。进一步的，交联反应的条件温和，反应温度在室温或常温下进行即可，交联反应的时间根据交联程度的要求可以为2~24h不等。为了更好的反应，一般将原料混合后，在4℃左右先维持10~30min，使透明质酸或其盐充分溶胀，然后再升至反应温度进行自交联反应。进一步的，反应后，通过透析、浸泡、洗涤、过滤等方式去除杂质，杂质为未交联的反应物等。透析、浸泡、洗涤所用的介质为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，其特征是：包括透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸或其盐在耦合剂、辅助耦合剂及中性或碱性水环境下进行交联反应的步骤；所述耦合剂为碳二亚胺类物质，所述辅助耦合剂为琥珀酰亚胺类物质。/n

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸与ε-聚赖氨酸交联的方法，其特征是：包括透明质酸或其盐和ε-聚赖氨酸或其盐在耦合剂、辅助耦合剂及中性或碱性水环境下进行交联反应的步骤；所述耦合剂为碳二亚胺类物质，所述辅助耦合剂为琥珀酰亚胺类物质。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：将透明质酸或其盐加入含ε-聚赖氨酸或其盐、耦合剂和辅助耦合剂的中性或碱性水环境中。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）将耦合剂、辅助耦合剂、ε-聚赖氨酸或其盐和水混合均匀；
（2）将上述溶液pH调至中性或碱性，再向其中加入透明质酸或其盐进行交联反应，得交联的复合凝胶；
（3）将上述交联的复合凝胶去除杂质、干燥，得到透明质酸与ε-聚赖氨酸复合交联物。


4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征是：所述碳二亚胺类物质包括1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺及其盐中的一种或多种，所述琥珀酰亚胺类物质包括N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或多种。


5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冠凤，石艳丽，钱晓路，董艳美，郭学平，
申请(专利权)人：华熙生物科技股份有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37