抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B-mFc及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗H5N1病毒入胞抗体PTD‑7B‑mFc，其碱基序列如序列表SEQID NO.7所示；制备方法为：按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2‑CH3基因序列，并在各组分之间插入相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作，该设计基因序列进行人工合成，合成的基因连接入前期构建的PTS载体中，构建PTS‑mFc表达载体，然后利用PCR扩增p ET‑28a‑PTD‑7B载体中的PTD‑7B片段，并将PTD‑7B片段克隆入PTS‑mFc表达载体，构建PTS‑PTD‑7B‑mFc表达载体；将构建的表达载体转化入大肠杆菌中，诱导表达并纯化，比较其抗病毒活性，并优选单分子入胞抗体；单分子入胞抗体在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用；结果表明本发明专利技术抗体效价为550TCID50。

【技术实现步骤摘要】
抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B-mFc及其应用
本专利技术属于生物工程及重大传染病防治领域，具体涉及抗高致病性禽流感H5N1病毒全人源单分子入胞抗体PTD-7B-mFc的制备，以及制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。
技术介绍
禽流感（AvianInfluenza）是由A型流感病毒引起的一种家禽和野禽的，从呼吸系统到全身败血症等多种症状的综合征。根据病毒表面结构蛋白和抗原性不同，可以将A型流感病毒分为多种血清亚型，目前已鉴定出17种HA亚型和10种NA亚型。根据禽流感病毒致病性和毒力不同，可以将禽流感分为高致病性、低致病性和无致病性。高致病性禽流感多由H5和H7亚型毒株引起，发病率和致死率很高，对社会经济及公共卫生具有严重影响。2004年初，H5亚型高致病性禽流感在我国16个省份暴发。由于禽流感病毒的血凝素结构等特点，一般感染禽类，当病毒在复制过程中发生基因重配，致使结构发生改变，获得感染人的能力，才可能造成人感染禽流感疾病的发生。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。其中，高致病性H5N1亚型和2013年3月在人体上首次发现的新禽流感H7N9亚型尤为引人关注，不仅造成了人类的伤亡，同时重创了家禽养殖业。目前用于防治H5N1病毒的药物主要有：神经氨酸酶抑制剂扎那米韦(Zanamivir，瑞乐砂)、奥司他韦(Oseltamivir，达菲)和M2离子通道蛋白抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺。但是扎那米韦口服生物利用度低，临床只有气雾剂应用，而无口服剂型限制了该药物的应用，奥司他韦易产生耐药性的问题限制了其应用，且该药生产能力有限，难以应对较大规模的高致病性禽流感疫情。金刚烷胺和金刚乙胺有强的神经毒副作用，也容易产生耐药病毒株。在病毒不断产生耐药性的情况下，新型抗体药物可能成为应对H5N1病毒引发潜在流感大流行的有效手段。目前针对人禽流感的治疗以使用抗病毒药物为主，当前批准的抗病毒药物包括两种离子通道抑制剂和两种神经氨酸酶抑制剂，但由于耐药相关位点突变等原因，流感病毒不断产生耐药。如果连续数年对重症及危重症患者超适应症使用抗病毒药物,以及将抗病毒药物作为预防性药物普遍使用,势必不能排除增加耐药的可能性、高风险以及由此导致的公共卫生安全严重后果。在此情况下，制备新型抗流感病毒药物非常必要。抗体对于严重流感的治疗非常有效，但异源抗体免疫原性强，临床应用易引发人体严重的变态反应。随着基因工程技术的发展，基因工程抗体的发展非常迅速，其中单链抗体以其特异性高、分子量小，结构简单，较亲本抗体免疫原性低，在临床应用中能够最大减轻异种蛋白引起的变态反应的独特优势，吸引了众多科研工作者的目光，其制备技术已趋于成熟，特别是噬菌体展示技术更提高了抗体及抗体基因的筛选效率。因此，单链抗体对病毒感染性疾病的治疗将发挥重要的作用。但单链抗体在体内半衰期比较短，一般仅为25-30分钟左右，导致其体内发挥中和病毒作用不彻底，所以必须增加单链抗体的体内稳定性，常用的方法为单链抗体偶联其它生物大分子或基因工程融合表达单链抗体-生物大分子。H5N1病毒最主要的中和抗体来自于表面糖蛋白血凝素（HA），所以HA成为以往主要研究靶标。然而H5N1病毒具有高度变异性，根据分子进化树分析预测结果显示H5N1病毒HA基因已演变成至少10种不同抗原性特征的变异分支，不同分支之间的免疫交叉反应较弱。鉴于病毒变异的影响，基于保守抗原组分的抗体能够对不同亚型禽流感病毒产生抗病毒作用。流感病毒基质蛋白M1是禽流感病毒主要的结构蛋白，位于病毒囊膜内侧，通过与宿主细胞靶蛋白结合而参与和调控病毒的复制、转录、释放等过程。M1蛋白序列保守，因此针对M1的抗体可以通过与M1蛋白结合，抑制其活性，干扰各亚型禽流感病毒的复制、转录及释放，从而起到广谱抗病毒的作用。蛋白转导域（Proteintransductiondomain,PTD）是能介导蛋白跨过细胞膜的小肽段，能够携带大分子有效通过生物膜进入细胞。PTD介导的蛋白转运不依赖于受体、通道、能量及胞吞作用，可以直接作用于所有类型细胞的脂质双分子层完成跨膜运动，而且其跨膜功能不具有物种特异性。自PTD被识别并鉴定以来，已经有数百种化合物和蛋白质被成功用于转导，携带生物大分子进入不同的细胞，并表现出了相应的生物活性。在已发现的PTD中，人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）TAT蛋白的PTD是研究最多、功能确切的，TAT蛋白PTD能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA以一种浓度依赖方式高效快速地转导入细胞内，而细胞的正常结构和功能不受影响。尽管蛋白转导的机制目前尚在研究中，但其可以直接将具有治疗作用的生物大分子送入细胞发挥生物学效应这一特性为疾病的生物治疗提供了新思路，因而在医学研究领域受到广泛关注。1997年，Vives等发现，TAT的PTD是位于47～57位的11个氨基酸（YGRKKRRQRRR），是一个富含碱性氨基酸的多肽片段。为了增加该PTD的转导效率，将其第二位的Gly突变为疏水性的His，鉴于TATPTD的生物转导特性，将该片段与抗M1蛋白ScFv或ScFv-mFc融合表达后，其可将抗M1抗体组分带入病毒感染细胞，靶向作用于胞内的M1蛋白，阻止其发挥生物功能，抑制流感病毒的装配和释放，从而起到抗病毒的作用。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种抗高致病性禽流感H5N1病毒全人源单分子入胞抗体PTD-7B-mFc的制备及其应用。PTD-7B-mFc单分子抗体，其碱基序列如序列表SEQIDNO.7所示。PTD-7B-mFc单分子抗体的制备方法，它包括：1）按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2-CH3基因序列，并在各组分之间插入相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作，该设计基因序列进行人工合成，合成的基因连接入前期构建的PTS载体中，构建PTS-mFc表达载体，然后利用PCR扩增pET-28a-PTD-7B载体中的PTD-7B片段，并将PTD-7B片段克隆入PTS-mFc表达载体，构建PTS-PTD-7B-mFc表达载体；所述的PTS载体为自行构建的PET-TrxA-SUMO载体；2）将构建好的表达载体转化入大肠杆菌中，诱导表达并纯化，比较其抗病毒活性，并优选单分子入胞抗体。PTD-7B-mFc单分子抗体在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。本专利技术提供了PTD-7B-mFc单分子抗体，其碱基序列如序列表SEQIDNO.7所示；制备方法为：按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2-CH3基因序列，并在各组分之间插入相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作，该设计基因序列进行人工合成，合成的基因连接入前期构建的PTS载体中，构建PTS-mFc表达载体，然后利用PCR扩增pET-28a-PTD-7B载体中的PTD-7B片段，并将PTD-7B片段克隆入PTS-mFc表达载体，构建PTS-PTD-7B-mFc表达载体；所述的PTS载体为自行构建的PET-TrxA-SUMO载体；将构建的表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B-mFc，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示。/n

【技术特征摘要】
1.抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B-mFc，其碱基序列如序列表SEQIDNO.7所示。


2.抗H5N1病毒入胞抗体PTD-7B-mFc的制备方法，它包括：
1）按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2-CH3基因序列，并在各组分之间插入相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作，该设计基因序列进行人工合成，合成的基因连接入前期构建的PTS载体中，构建PTS-mFc表达载体，然后利用PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国利，田园，岳玉环，王铁成，刘雨玲，吴广谋，李泽鸿，刘楚含，雍伟，高玉伟，邓欣，卢士伟，那漫，王冬冬，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22