一种基于二维凝胶电泳用于复杂蛋白质样品分离的装置，该分离包括基于等电点的第一维胶条中的第一分离和基于分子大小的第二维凝胶中的第二分离，该装置包括用于第一分离步骤的至少两个凝胶条和用于第二维分离的对应凝胶。将两个凝胶条排列在单个载体上的相同侧或相对侧。因具有至少两个第一凝胶条，可以平行执行至少两个分析过程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及根据权利要求1介绍的基于二维凝胶电泳的用于分离原因分析用样品混合物的装置(arrangement)，以及建议用于集成和自动化方式的凝胶电泳分析方法。具体来说，本专利技术涉及凝胶电泳的有利实施方案，通过基于快速UV凝胶聚合作用和SDS电动平衡而无需使用阀门，扩大基于专利申请EP 1712903 A1中公开的方法的范围，以提供方便和有效的方式来实现平行分析和比较研究。
技术介绍
二维平板凝胶电泳仍是蛋白质组学的最常用方法，并且如果解决了现在存在的其它限制，这种情况可能仍会持续多年。实际上，它仍然是耗时且工作繁重的过程，需要训练有素的人员，结果质量主要取决于这些人员之手。虽然电泳后步骤高度自动化，但是分离步骤距此目标尚远，因此由保持在控制下的各种参数的变化产生精确性和一致性的问题。某些问题是例如，就样品量而言的样品加载和再水化，就匀质性、灌制和反应速度、尤其是粒度而言的胶条损失和匀质性、具有损坏和污染风险的胶条处理、胶条与凝胶的不精确或缓慢偶联、凝胶灌制和聚合，空气敏感度，运行开始前完成的时间，由此还导致场不连续的胶条气泡风险、运行期间温度升高、pH和粘度变化、缓冲容量的损失。缺乏可接受再现性，这意味着没有两个凝胶图像可直接重叠，由此在考虑主要将凝胶进行比较，例如检测和定量试验样品对之间的蛋白质表达差异的情况下，其仍是主要问题。就实际的情况而言，这解释为需要运行更多凝胶以构建每种条件的参考图像并达到某种程度的确定性，这又意味着甚至更多的手工工作。在1997年，引入了明显克服此问题的技术，即荧光2-D差示凝胶电泳(DIGE)。这基于使用荧光花青染料Cy3和Cy5的两种质量和电荷匹配的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物(它们具有不同的激发和发射光谱)，以差异性地标记两个蛋白质样品的赖氨酸残基，然后将它们混合并在相同的凝胶上运行。因此，匹配是自动且直接的，理论上仅单个凝胶即可足够。但是，为了适合的统计评估，还至少需要三至五个凝胶。使事情比之前甚至更复杂的是，要遵循非常苛刻的标记条件。实际众所周知的是，预先标记可以生成大量位置异构物以及部分反应的类型，从而得到非常不均一的结果。因此，标记必须最小化，以尝试实现添加到整个蛋白质分子上的单个赖氨酸残基上。此外，过度反应的种类还可能由于获得增加的疏水性而沉淀，但是最大的问题是无法仅运行一个DIGE凝胶就切出差异化表达的蛋白质斑点用于后续MS分析。实际上，没有办法预测共价荧光标记将附着于哪个赖氨酸，和由此附着于哪个消化斑点的肽，由此肽的鉴定可成为问题所在。而且，从荧光扫描仪移出凝胶之后，斑点不再可见，由此需要以任何方式使用Sypro Ruby或其它可视染色技术以实现电泳后可视化。最终，或许最大的限制表现为非常高成本的设备、软件和试剂。与更好再现性相关的自动化是对仪器色谱分析方法的主要优势，因为加载样品之后不再需要手动干预。尽管如此，这仅在以先后顺序逐个样品使用相同色谱柱和运行相同方法时才成立。使用相同材料填充的相同尺寸的色谱柱实际可以产生不同的洗脱时间，因为色谱柱填充本身不是良好可再现的。例如monoliths的新材料具有新的优点，但是仍要逐个生产色谱柱，这意味着与凝胶类似，没有平行运行的两个色谱分析可以重叠。除此之外，因成本和仪器复杂性导致的限制使得该方法毕竟不是更快速且实际更方便，尽管具有其它固有优点例如在线检测和直接与MS偶联的可能性。另一方面，凝胶可以容易地以平行方式运行，可以在最优条件下提供更好的分辨率，并可以通过成像直接比较。因此如果对凝胶也实现集成和自动化，由此实现更高的可再现性和通量，允许以更少的工作量和降低的成本在更少时间内运行更多且可比较的凝胶，则其潜力仍是非常大的。在前一申请EP 1712903 A1中，引入了对一般方法的修改，基于无阀第一维SDS电动平衡与快速UV聚合之间的组合，最终得到真正简单的集成且自动化的系统以及优于现有技术的其它重要优点，稍后将再次回顾和描述其中最重要的部分。出于简化和更好地理解EP 1712903 A1内提出的专利技术的原因，二维凝胶电泳分析的各种方法或过程步骤是按操作顺序描述的。如下是执行开发的方法时所涉及步骤的简要列表，之后是对它们的论述1.在IEF(等电聚焦)之前执行还原/烷基化。2.加载样品。3.以任何如下提出的方式运行IEF。4.增加胶条与凝胶模背面的间距。5.在实现同时偶联和聚合的同时引入用于第二维分离的凝胶溶液。6.以电动学方式将SDS引入聚焦的蛋白质。7.置换运行缓冲器并运行第二维。8.打开凝胶模以移出凝胶。9.进行固定和染色。在各个步骤的下文描述中，还参考附图1-7，其中显示出分别根据EP 1712903 A1开发的系统或设备的可能实施方案和部分。步骤1还原/烷基化作为根据的样品制备的最后一步在加载样品之前进行。优选使用相同的还原剂和烷基化剂，即三丁基膦(TBP)和乙烯基吡啶(vinyl pirydine，VP)，虽然对该方法稍作修改。已经发现并无必要缓冲发生烷基化反应的样品溶液，因此避免了盐浓度的无意义增加，而高盐浓度会导致高电流和较长的IEF时间(除非实施了脱盐)。而且，认为在两个连续步骤中而非同时添加TPB和VP更有效率，因为这两种试剂可相互反应。以此方式，所需要的反应时间也更短，例如总共30分钟。例如，用于溶解蛋白质样品的典型溶液由如下组成(当然允许有所变化) 为此，添加TBP，例如首先在浓度5mM下持续约10分钟，然后添加VP 20mM最终浓度持续约20分钟，再添加足够摩尔量的TBP以猝灭过量的前一种试剂，而非添加另一种还原试剂如二硫赤藓糖醇(DTE)。1，2-丙二醇是例如甘油、PEG、二甘醇的其它可能添加剂中较常用的添加剂，其作用是将IEF期间的EOF最小化，同时维持样品溶液的低粘度，正如下文所见到的，这对于样品加载步骤是重要的。步骤2如图1定义和图示的，将例如在上文溶液中的样品置入，例如用吸移管移入小样品孔中，其中该样品接触胶条和直接面对胶条的一次性容器的内表面，并根据本专利技术的计划由此表面与整个充满色谱柱的半干胶条之间的毛细管亲水力导向。图1分别显示出2D凝胶电泳分析设备或一次性容器内的EP 1712903 A1提出的第一胶条纵截面部分。上述样品1被插入到样品槽3中，并沿着箭头所示方向导向毛细管开口5、亲水性凝胶条7。优选但非必需的，与胶条对应的区域是亲水性的，而一次性容器11的表面9的至少其余部分是疏水性的或无凝胶附着的。也可仅通过在下方复制胶条尺寸的一次性容器上的两条平行划线来增强样品导向。在粘附胶条的相同覆盖面上可能需要凝胶粘附，这里可完全是亲水性的或具有凝胶结合特性。如果这是例如箔，则优点在于最后可以将它与胶条一起剥离，使得处理更容易且使损坏的风险最小化。可以采用压力或真空来协助加样，但是一般避免使用。在此受控的方式中，可以引入刚好对应于再水合胶条所需的量的样品体积，从而使浪费最小。步骤3要注意的是，胶条7没有在两端通过任何阀门封闭。因为凝胶模几乎在所有的面封闭，并且在IEF一次性放置在例如冷却板上的期间优选将温度保持凉爽，蒸发被最小化。可以使用可商业获得的胶条，其中该胶条已经被集成在封闭的压缩一次性容器中，或附着于封盖来单独提供，该封盖封闭主一次性容器。还本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于二维凝胶电泳用于分离复杂蛋白质样品的装置，所述分离包括基于等电点的第一维胶条中的第一分离和基于分子大小的第二维凝胶中的第二分离，其特征在于，将所述第一分离步骤的至少两个凝胶条和所述第二维的对应凝胶排列在单个载体上的相同侧或相对侧，并可平行执行至少两个分析过程。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M库尔西奥，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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