一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法技术

一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法，步骤：使用含有PDA培养基的无菌平皿进行菌丝培养；将培养基上爬满有羊肚菌菌丝的盖玻片取出且分成对照组和实验组；将对照组和实验组盖玻片浸泡于溶剂中，浸泡结束后对盖玻片洗涤，洗涤结束后向盖玻片上滴加固定液；用缓冲液洗涤由固定液固定的羊肚菌菌丝，将对照组和实验组盖玻片放入洁净染色盒，向染色盒中加入染色固定液；用缓冲液洗涤染色完成的羊肚菌菌丝，用滤纸吸干盖玻片上的残留缓冲液，向盖玻片中央滴加抗荧光淬灭封片液，使羊肚菌菌丝与抗荧光淬灭封片液接触，制作对照组和实验组的玻片样品。有助于对羊肚菌的生长、发育、繁殖、衰老及栽培过程中的长势和产量等因素的了解，利于预判。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法
本专利技术属于食用菌菌丝细胞检测
，具体涉及一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法。
技术介绍
前述的羊肚菌（Morchellaspp.）又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等等。由于菌盖表面凹凸不平并且形状如羊肚，因而称之为羊肚菌，羊肚菌也被收录于李时珍的《本草纲目》一书中。羊肚菌是一种较为珍贵的天然补品，含有丰富的蛋白质、多种维生素及二十余种氨基酸、味道鲜美、营养丰富。羊肚菌与冬虫夏草的功用趋于相同，是一种不含任何激素，无任何副作用的天然滋补品。尤其是经现代医学研究表明：羊肚菌有降血脂、调节免疫功能、抗衰老、抗疲劳、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤以及减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用，等等。如业界所知，细胞核浓缩是细胞凋亡形态特征之一，细胞凋亡表现出的特征呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，并且细胞表面有“出芽”现象。在光学显微镜下可观察到凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化、核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。HE染色法（hematoxylin-eosinstaining）和Giemsa染色法（音译：吉姆萨染色法）是目前常用的方法，在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在丝状真菌中，核浓缩的检测直接对菌丝染色较为方便快捷，并且可以通过核浓缩情况对细胞凋亡进行初步判断。但是，由于有些真菌本身细胞核的大小差异明显，因而做细胞核染色检测时核浓缩现象不容易观察，通常需要特异性的荧光染料进行细胞核染色后观察。由于羊肚菌菌丝细胞的凋亡对羊肚菌的生长、发育、繁殖、衰老诸方面均有一定影响，因而研究羊肚菌菌丝细胞凋亡具有重要且积极的意义。然而，在迄今为止公开的中外专利和非专利文献中均未见与检测羊肚菌菌丝细胞凋亡相关的技术信息，下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。
技术实现思路
本专利技术的任务在于提供一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法，该方法能有效地检测羊肚菌菌丝细胞核浓缩，并对菌丝的细胞凋亡情况进行预判。本专利技术的任务是这样来完成的，一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法，包括以下步骤：A)羊肚菌菌丝培养，使用含有PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）的无菌平皿进行菌丝培养，先用打孔器在长满羊肚菌菌丝的培养基边缘处打孔，接种至所述培养基的中央，接着在培养基上斜插四枚离平皿中央距离相等的盖玻片，恒温培养，使羊肚菌菌丝爬满于所述的盖玻片；B)羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述培养基上爬满有羊肚菌菌丝的盖玻片全部取出并且分成对照组和实验组，对照组经不同处理后继续恒温培养，而对实验组经不同处理后进行高温胁迫，并且控制高温胁迫的温度和胁迫时间，所述的对照组以及实验组不同处理各包括加外源抑制剂和不加外源抑制剂，得到对照组和实验组盖玻片；C)羊肚菌菌丝固定，将由步骤B)得到的对照组和实验组盖玻片浸泡于溶剂中，浸泡结束后用缓冲液对所述的盖玻片洗涤，洗涤结束后向盖玻片上滴加用于对羊肚菌菌丝固定的固定液并且控制固定液的滴加量以及控制固定液对羊肚菌菌丝的固定时间；D)羊肚菌菌丝染色，用缓冲液洗涤步骤C）所述的由固定液固定的羊肚菌菌丝，并且将所述的对照组和实验组盖玻片分别放入洁净染色盒，向染色盒中加入染色固定液并使对照组和实验组盖玻片浸没于染色固定液，控制加入的染色固定液的量以及控制染色时间，得到染色完成的羊肚菌菌丝；E)羊肚菌菌丝细胞核浓缩检测，用缓冲液洗涤步骤D）染色完成的羊肚菌菌丝，并用滤纸吸干盖玻片上的残留的缓冲液，向盖玻片中央滴加抗荧光淬灭封片液，使羊肚菌菌丝充分与所述抗荧光淬灭封片液接触，制作对照组和实验组的玻片样品，置于荧光显微镜并在346nm-460nm激发波长下观察，根据对照组和实验组细胞核激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞核浓缩情况。在本专利技术的一个具体的实施例中，步骤A）中所述的培养基边缘处打孔是围绕PDA培养基的边缘部位的四周以等距离间隔状态打孔，孔的直径为4mm-6mm；所述恒温培养的温度为18℃-22℃，恒温培养时间为72h-100h。在本专利技术的另一个具体的实施例中，步骤B）中所述的控制高温胁迫的温度是将高温胁迫的温度控制为40℃-45℃，所述控制高温胁迫的时间是将时间控制为30min-250min。在本专利技术的又一个具体的实施例中，步骤B)中所述的外源抑制剂为N-乙酰半脱氨酸（NAC）或寡霉素（oligomycin）。在本专利技术的再一个具体的实施例中，步骤C）、步骤D）和步骤E）中所述的缓冲液为10×PBS缓冲液，所述洗涤的次数为2-4次并且每次的时间为2min-5min。在本专利技术的还有一个具体的实施例中，步骤C）中所述的将由步骤B）得到的所述对照组和实验组盖玻片浸泡于溶剂中的浸泡时间为4min-6min，所述的溶剂为质量百分比浓度为65%-75%的乙醇。在本专利技术的更而一个具体的实施例中，步骤C）中所述的控制固定液的滴加量是将固定液的滴加量控制为0.1ml-0.5ml；所述控制固定液对羊肚菌菌丝的固定时间是将固定时间控制为8min-12min；所述的固定液为质量百分比浓度为3.7%的甲醛PBS固定液。在本专利技术的进而一个具体的实施例中，步骤D）中所述控制加入的染色固定液的量是将加入的染色固定液的量控制为0.5ml-1ml，所述的控制染色时间是将染色时间控制为5min-10min；所述的染色固定液为Hoechst33258染色固定液。在本专利技术的进而一个具体的实施例中，步骤A）至步骤E)所述的羊肚菌菌丝为六妹羊肚菌菌丝。本专利技术提供的技术方案的技术效果在于：由于开创性地提供了对羊肚菌菌丝细胞的快速检测方法，因而有助于对羊肚菌的生长、发育、繁殖、衰老以及栽培过程中的长势和产量之类的因素了解并且利于进行预判。附图说明图1为实施例1对照组羊肚菌菌丝细胞核的荧光显色图。图2为实施例1实验组羊肚菌菌丝细胞核的荧光显色图。图3为实施例1对照组羊肚菌菌丝高温刺激后添加外源抑制剂后的细胞核的荧光显色图。图4为实施例1实验组羊肚菌菌丝高温刺激后添加外源抑制剂后的细胞核的荧光显色图。图5为实施例1对照组、实验组羊肚菌菌丝添加外源抑制剂后的细胞核的浓缩数量变化图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：本专利技术提供的细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法包括以下步骤：A)羊肚菌菌丝培养，本实施例所述的羊肚菌为六妹羊肚菌，先用打孔器在长满六妹羊肚菌菌丝并且位于平皿内的PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基的边缘处打孔，具体是：围绕PDA培养基的边缘部位优选以等距离间隔状态打若干个直径为6m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法，其特征在于包括以下步骤：/nA)羊肚菌菌丝培养，使用含有PDA培养基的无菌平皿进行菌丝培养，先用打孔器在长满羊肚菌菌丝的培养基边缘处打孔，接种至所述培养基的中央，接着在培养基上斜插四枚离平皿中央距离相等的盖玻片，恒温培养，使羊肚菌菌丝爬满于所述的盖玻片；/nB)羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述培养基上爬满有羊肚菌菌丝的盖玻片全部取出并且分成对照组和实验组，对照组经不同处理后继续恒温培养，而对实验组经不同处理后进行高温胁迫，并且控制高温胁迫的温度和胁迫时间，所述的对照组以及实验组不同处理各包括加外源抑制剂和不加外源抑制剂，得到对照组和实验组盖玻片；/nC)羊肚菌菌丝固定，将由步骤B)得到的对照组和实验组盖玻片浸泡于溶剂中，浸泡结束后用缓冲液对所述的盖玻片洗涤，洗涤结束后向盖玻片上滴加用于对羊肚菌菌丝固定的固定液并且控制固定液的滴加量以及控制固定液对羊肚菌菌丝的固定时间；/nD)羊肚菌菌丝染色，用缓冲液洗涤步骤C）所述的由固定液固定的羊肚菌菌丝，并且将所述的对照组和实验组盖玻片分别放入洁净染色盒，向染色盒中加入染色固定液并使对照组和实验组盖玻片浸没于染色固定液，控制加入的染色固定液的量以及控制染色时间，得到染色完成的羊肚菌菌丝；/nE)羊肚菌菌丝细胞核浓缩检测，用缓冲液洗涤步骤D）染色完成的羊肚菌菌丝，并用滤纸吸干盖玻片上的残留的缓冲液，向盖玻片中央滴加抗荧光淬灭封片液，使羊肚菌菌丝充分与所述抗荧光淬灭封片液接触，制作对照组和实验组的玻片样品，置于荧光显微镜并在346nm-460nm激发波长下观察，根据对照组和实验组细胞核激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞核浓缩情况。/n...

【技术特征摘要】
1.一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法，其特征在于包括以下步骤：
A)羊肚菌菌丝培养，使用含有PDA培养基的无菌平皿进行菌丝培养，先用打孔器在长满羊肚菌菌丝的培养基边缘处打孔，接种至所述培养基的中央，接着在培养基上斜插四枚离平皿中央距离相等的盖玻片，恒温培养，使羊肚菌菌丝爬满于所述的盖玻片；
B)羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述培养基上爬满有羊肚菌菌丝的盖玻片全部取出并且分成对照组和实验组，对照组经不同处理后继续恒温培养，而对实验组经不同处理后进行高温胁迫，并且控制高温胁迫的温度和胁迫时间，所述的对照组以及实验组不同处理各包括加外源抑制剂和不加外源抑制剂，得到对照组和实验组盖玻片；
C)羊肚菌菌丝固定，将由步骤B)得到的对照组和实验组盖玻片浸泡于溶剂中，浸泡结束后用缓冲液对所述的盖玻片洗涤，洗涤结束后向盖玻片上滴加用于对羊肚菌菌丝固定的固定液并且控制固定液的滴加量以及控制固定液对羊肚菌菌丝的固定时间；
D)羊肚菌菌丝染色，用缓冲液洗涤步骤C）所述的由固定液固定的羊肚菌菌丝，并且将所述的对照组和实验组盖玻片分别放入洁净染色盒，向染色盒中加入染色固定液并使对照组和实验组盖玻片浸没于染色固定液，控制加入的染色固定液的量以及控制染色时间，得到染色完成的羊肚菌菌丝；
E)羊肚菌菌丝细胞核浓缩检测，用缓冲液洗涤步骤D）染色完成的羊肚菌菌丝，并用滤纸吸干盖玻片上的残留的缓冲液，向盖玻片中央滴加抗荧光淬灭封片液，使羊肚菌菌丝充分与所述抗荧光淬灭封片液接触，制作对照组和实验组的玻片样品，置于荧光显微镜并在346nm-460nm激发波长下观察，根据对照组和实验组细胞核激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞核浓缩情况。


2.根据权利要求1所述的一种细胞核染色检测羊肚菌菌丝核浓缩的方法，其特征在于步骤A）中所述的培养基边缘处打孔是围绕PDA培养基的边缘部位的四周以等距离间隔状态打孔，孔的直径为4mm-6mm；所述恒温培养的温...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋驰，肖湘月，张宇晨，俞晓明，冀宏，蔡小龙，陈业虎，吴亮亮，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32