本发明专利技术公开了一种黄烷酮‑3‑羟化酶抗原表位肽及其融合蛋白和其特异性抗体，以及抗体的制备方法与应用。所述黄烷酮‑3‑羟化酶抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明专利技术的特异性抗体，本发明专利技术制备的多克隆抗体亲和力强、特异性好，灵敏度高、操作简便，可与水稻黄烷酮‑3‑羟化酶发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，为水稻黄烷酮‑3‑羟化酶的相关生理功能研究及鉴定提供了一个重要的工具。
【技术实现步骤摘要】
黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽及其抗体与应用
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽、融合蛋白、黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
植物体中的类黄酮化合物因具有一定药用价值而备受科学家关注，花色苷是一种水溶性黄酮类化合物，属于类黄酮次生代谢产物，在植物各种器官和组织中均有不同含量的分布，在花色形成、果实着色等过程中起着关键的作用。大量研究证实，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、保护心脑血管、抗肿瘤和抗炎症等多种药用价值。花色苷的合成是一个多酶反应途径，其中黄烷酮-3-羧化酶(flavanone3-hydroxylase，F3H)是多酶生物合成途径中关键酶之一。因此，研究类黄酮合成途径关键酶可以为植物次生代谢物积累机制提供基础生理和分子研究支持，为其药用研究提供基础。F3H作为黄酮醇、花青素和原花青素合成途径的共有关键酶，是整个类黄酮合成途径枢纽位点。F3H属于依赖型2-酮戊二酸双加氧酶(2-ODD)家族，反应需要依赖铁、分子氧、2-酮戊二酸和抗坏血酸等作为辅助因子，具有底物特异性，其作用是催化柚皮素的C3位羟基化，生成二氢山奈素。F3H以柚皮素为作用底物，参与黄酮和花青素合成代谢途径的调控，是代谢过程中的关键酶。F3H基因最早从金鱼草中分离得到，经过对矮牵牛的分析和研究发现，F3H是一种单体蛋白。目前已陆续从拟南芥、矮牵牛、玉米、甘蓝型油菜、苜蓿、苹果、康乃馨、银杏及苦荞等多种植物中克隆得到F3H基因。由于蛋白质家族的成员众多，所以对植物中花色苷生物合成关键酶分析鉴定主要运用单向/双向电泳技术和液相色谱联合质谱技术。其鉴定仪器贵鉴定技术过程复杂并且繁琐，而在多克隆抗体制备过程中由于多个抗原决定簇的存在，重组蛋白的表达和纯化过程中不可避免的会掺入一些杂蛋白，制备的抗体仍有可能存在交叉反应，从而影响抗体的特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽、黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体及其制备方法与应用，本专利技术发掘了一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽；该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本专利技术的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，该抗体具有很高的灵敏性。本专利技术是这样实现的：本专利技术目的之一在于提供一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽可直接通过公司合成得到；或通过构建含有所述氨基酸序列所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽。本专利技术的目的之二在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽和任选的标签序列。优选地，所述的标签序列为在所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽的C端增加的1个半胱氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。优选地，所述标签序列半胱氨酸Cys上的巯基通过偶联剂偶联有载体蛋白。更为优选地，所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白，所述偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯。所述的融合蛋白可直接通过公司合成得到或先合成黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽经改造后得到；或通过构建含有所述融合蛋白所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到所述的融合蛋白。本专利技术的目的之三在于提供一种黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，所述抗体特异性的结合所述的抗原表位肽或所述的融合蛋白，并且所述抗体能够特异性地结合天然的黄烷酮-3-羟化酶蛋白和/或突变的黄烷酮-3-羟化酶蛋白。本专利技术的目的之四在于提供一种黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体的制备方法，将所述的抗原表位肽或所述的融合蛋白免疫动物，取血清从中分离纯化得到的多克隆抗体即为该黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体。优选地，使用亲和层析柱进行多克隆抗体的分离纯化，所述亲和层析柱含有溴化氰活化琼脂糖填料，洗脱缓冲液是pH2.7的50mM甘氨酸，所制得的抗体具有较高的纯度、得率和效价。本专利技术的目的之五在于提供所述的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体的用途，用于黄烷酮-3-羟化酶的检测；或制备检测花黄烷酮-3-羟化酶的试剂或试剂盒。具体地，可将所述的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体用于有色作物红米的黄烷酮-3-羟化酶检测。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次发掘了一种黄烷酮-3-羟化酶F3H抗原表位肽，该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原，所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本专利技术的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，该抗体可对有色稻中黄烷酮-3-羟化酶F3H进行检测，该抗体具有特异性强、灵敏度高、准确性高、操作简便、结果直观和成本低廉等优点。且制备方法操作简单，具有工业化生产的可行性。附图说明图1为本专利技术制备的特异性抗体蛋白免疫印迹检测红米RM1、白米9311中的黄烷酮-3-羟化酶，5个泳道从左至右分别为marker、两品种花后5天、10天、15天以及成熟期颖果的蛋白免疫印迹。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1候选黄烷酮-3-羟化酶F3H抗原表位的发掘和多肽抗原的合成1、以特种水稻(OryzasativeL)“罗田红米”(简称RM1)为研究对象，其黄烷酮-3-羟化酶F3H的基因F3H-2(Os10g0536400)，核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，编码的氨基酸全长序列如SEQIDNO：4所示。分析氨基酸序列的亲水性、表露性和柔韧性等，在该蛋白的N端选出了一端氨基酸序列CRTHGFFQVVNHGI，如SEQIDNO：1所示，该序列位于SEQIDNO：4中的第64-77位氨基酸序列，经过BLAST对比数据库，确定该段多肽能代表植物黄烷酮-3-羟化酶(水稻Os-F3H)抗原表位。2、依据以上序列分析的抗原决定簇的预测结果，在黄烷酮-3-羟化酶F3H特异性抗原决定簇多肽序列的C端加上一个半胱氨酸残基(Cysteineresidue，Cys)，通过9-芴甲氧羰基保护α-氨基进行固相合成抗原序列(SEQIDNO：2)，并经由琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯为偶联剂偶联一个大分子载体匙孔血蓝蛋白(Keyholelimpethemocyanin，KLH)形成抗原，冻干保存在-80℃。实施例2黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体anti-F3H的制备免疫动物选择年龄为3个月左右、体重2kg以上的健康新西兰大白兔。对兔子进行免疫前诱导，通过四肢、腋下及背部皮下注射0.5mL弗氏完全佐剂，刺激局部免疫反应。7天后进行首次免疫，同本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括权利要求1所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽和任选的标签序列。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述的标签序列为在所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽的C端增加的1个半胱氨酸，所述半胱氨酸的巯基上偶联有载体蛋白。
4.如权利要求3所述的的融合蛋白，其特征在于：所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白。
5.一种黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，其特征在于：所述抗体特异性的结合权利要求1所述的抗原表位肽或权利要求2－4任何一项所述的融合蛋白，并且所述抗体能够特异性地结合天然的黄烷酮-3-羟化酶蛋白和...
【专利技术属性】
技术研发人员：何莹，孙玉珺，罗雅，汪倩，曾汉来，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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