一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法，其中，黄递酶突变体是将野生型黄递酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸获得的，黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该黄递酶突变体的酶学性质与野生型黄递酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH的稳定范围较广；该黄递酶突变体的制备方法采用基因工程手段，将黄递酶突变体基因克隆到表达载体，转化宿主细胞进行原核表达，可获得大量高稳定性黄递酶突变体，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法。
技术介绍
黄递酶(Diaphorases)，简称DIA，又称心肌黄酶、硫辛酰胺脱氢酶。黄递酶在体内的电子传递系统中起着重要的作用，能催化二氢硫辛酰胺或二氢硫辛酸脱氢，分别成为硫辛酰胺和硫辛酸外，也可催化人工电子受体还原，如某些染料、铁氰酸盐、醌等。脱去的两个氢能将FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)还原为FADH2，再传递给NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸+)而形成NADH和H+。此外，黄递酶在体外的应用也得到了了大量的研究，例如在生产有用的材料、能源相关材料、环境保护、医学等领域中的应用，并且其中一些已经得到了实际应用。例如，在临床诊断领域，以还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸磷酸根(NADPH)为底物，利用黄递酶的特性，用于形成各种体外诊断试剂，例如可用于β-羟丁酸测定试剂盒，用来测定血清中β-羟丁酸含量。此外，黄递酶还可用作酶电池，属于燃料电池的一种。黄递酶可从猪心肌中提取，也可以由嗜热脂肪芽孢杆菌或克氏梭菌等微生物发酵产生。而从动物的心肌中提取黄递酶不仅操作复杂，而且产量低，不便于规模化生产。而我国目前黄递酶主要依赖于进口，价格昂贵，且目前现有的黄递酶热稳定性差，用于β-羟丁酸测定试剂盒不利于准确测定β-羟丁酸含量。因此，需要一种可大量生产具有高热稳定性黄递酶的方法。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法，该黄递酶突变体的酶学性质与野生型黄递酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH的稳定范围较广；该黄递酶突变体的制备方法采用基因工程手段，将黄递酶突变体基因克隆到表达载体，转化宿主细胞进行原核表达，可获得大量高稳定性黄递酶突变体，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产成本。为了解决上述问题，本专利技术的一方面提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体，所述黄递酶突变体是将野生型黄递酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸获得的，所述黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术对氨基酸序列为SEQIDNO：3所示的野生型黄递酶的第122位氨基酸进行突变，将野生型黄递酶的第122位由甘氨酸突变为天冬氨酸，获得的黄递酶突变体与野生型黄递酶、现有进口的黄递酶相比，酶学性质接近，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH适用范围广。所述SEQIDNO：1的序列结构如下：MAKVLYITAHPHDDTQSYSMAVGKAFIETYKQVHPDHEVIHLDLYKEYIPEIDVDVFSGWGKLRSGQSFEQLSAEEKTKVGRMNELCDQFISADKYVFVTPMWNFSFPPVLKAYIDAVAVADKTFKYTAQGPIGLLTDKKALHIQARGGFYSEGPAAQMEMGHRYLEIIMQFFGVPSFEGLFVEGHAAVPEKAEEIKANAIARAKELAHTF。所述SEQIDNO：3的序列结构如下：MAKVLYITAHPHDDTQSYSMAVGKAFIETYKQVHPDHEVIHLDLYKEYIPEIDVDVFSGWGKLRSGQSFEQLSAEEKTKVGRMNELCDQFISADKYVFVTPMWNFSFPPVLKAYIDAVAVAGKTFKYTAQGPIGLLTDKKALHIQARGGFYSEGPAAQMEMGHRYLEIIMQFFGVPSFEGLFVEGHAAVPEKAEEIKANAIARAKELAHTF。本专利技术的另一方面提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体基因，所述黄递酶突变体基因编码上述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。按照大肠杆菌的密码子偏好性对上述氨基酸序列的编码基因进行优化，获得适合大肠杆菌表达的DNA序列，优选地，黄递酶突变体基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。所述SEQIDNO：2的序列结构如下：atggctaaagttctgtacatcaccgctcacccgcacgacgacacccagtcttactctatggctgttggtaaagctttcatcgaaacctacaaacaggttcacccggaccacgaagttatccacctggacctgtacaaagaatacatcccggaaatcgacgttgacgttttctctggttggggtaaactgcgttctggtcagtctttcgaacagctgtctgctgaagaaaaaaccaaagttggtcgtatgaacgaactgtgcgaccagttcatctctgctgacaaatacgttttcgttaccccgatgtggaacttctctttcccgccggttctgaaagcttacatcgacgctgttgctgttgctgacaaaaccttcaaatacaccgctcagggtccgatcggtctgctgaccgacaaaaaagctctgcacatccaggctcgtggtggtttctactctgaaggtccggctgctcagatggaaatgggtcaccgttacctggaaatcatcatgcagttcttcggtgttccgtctttcgaaggtctgttcgttgaaggtcacgctgctgttccggaaaaagctgaagaaatcaaagctaacgctatcgctcgtgctaaagaactggctcacaccttc。本专利技术的再一方面提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的黄递酶突变体基因。所述重组载体可以为质粒、λ噬菌体的衍生物或动植物病毒，优选地，所述重组载体为质粒。质粒优选为pET28a。本专利技术的再一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的黄递酶突变体基因。所述宿主细胞可以是大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞中的一种。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术的再一方面提供一种试剂盒，包含上述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。优选地，所述试剂盒为β-羟丁酸测定试剂盒。本专利技术的再一方面提供一种制备高热稳定性黄递酶突变体的方法，包括以下步骤：S1.构建高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株，所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株含有上述的黄递酶突变体基因；S2.将所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于种子培养基中，进行种子培养；S3.将种子培养后的所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到所述高热稳定性黄递酶突变体。本专利技术利用基因工程方法，先构建出具有黄递酶突变体基因的基因工程菌株，然后对基因工程菌株进行培养并发酵，以实现黄递酶突变体的原核表达，经分离、纯化可获得大量黄递酶突变体，该黄递酶突变体的酶学性质与野生型黄递酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH适用范围广，可通过该方法大量生产，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有高热稳定性的黄递酶突变体，其特征在于，所述黄递酶突变体是将野生型黄递酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸获得的，所述黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有高热稳定性的黄递酶突变体，其特征在于，所述黄递酶突变体是将野生型黄递酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸获得的，所述黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种具有高热稳定性的黄递酶突变体基因，其特征在于，所述黄递酶突变体基因编码如权利要求1所述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。


3.根据权利要求2所述的具有高热稳定性的黄递酶突变体基因，其特征在于，所述黄递酶突变体基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有如权利要求2或3所述的黄递酶突变体基因。


5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求2或3所述的黄递酶突变体基因。


6.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。


7.一种制备高热稳定性黄递酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株，所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株含有如权利要求2或3所述的黄递酶突变体基因；
S2.将所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于种子培养基中，进行种子培养；
S3.将种子培养后的所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到所述高热稳定性黄递酶突变体。

【专利技术属性】
技术研发人员：岳硕豪，郑长龙，
申请(专利权)人：北京达成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11