本发明专利技术公开了一种整体型固定化ｐＨ梯度的制备方法及其应用，其制备方法为先配制一系列由酸、碱以及中性单体组成的具有不同ｐＨ值的溶液，每一种溶液聚合得到一个ｐＨ梯度，多个梯度组合得到宽范围的ｐＨ梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法将ｐＨ梯度固定在柱形容器中，即得整体型固定化ｐＨ梯度。与现有技术相比，本发明专利技术方法可方便地制备１～１４之间任意范围的固定化ｐＨ梯度，无须使用商品两性电解质，操作简便，成本低，所制得的ｐＨ梯度用于等电聚焦分离蛋白质、多肽等两性电解质，具有梯度稳定、分辨率高、可反复使用、适合于纯化制备等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种整体型固定化PH梯度的制备方法及其在等电聚焦分离两性电 解质中的应用，属于两性电解质的分离介质的
技术介绍
现代蛋白组分离技术主要是基于二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D PAGE)及强 阳离子交换-反相高效液相色谱(SCX RP-HPLC)，其中后者又称鸟枪技术。迄今为止，2D PAGE仍然是最强大的蛋白组分离技术，但却伴随着耗时长、操作难的缺点。固定化pH梯度( IPG)的专利技术大大提高了2D PAGE的重现性，并能够增加上样量，从而改善灵敏度。用户可以 根据实际情况灵活选用或调配制作不同范围胶条，窄梯度的胶条能显著提高分辨率，多条覆 盖窄pH范围的胶条组合起来使用，可以大幅提高显示的蛋白点数目。IPG的缺点是一次性使 用、机械强度低、只能依靠电流驱动。在鸟枪技术中，蛋白质混合物先酶解为肽，再经液相 色谱分离，导致原始蛋白质的破坏，使标记物的提取最终必须依赖其它方法。近几年的研究表明，毛细管电泳技术有较多优势，包括分辨率高、样品消耗少、容易自 动化等等，因而越来越多地被应用于蛋白组学及生物标记物的发现研究中。毛细管等电聚焦 (CIEF)是一种重要的根据等电点分离肽、蛋白质等两性物质的技术。早期的等电聚焦实验之 所以往往难以与质谱检测技术匹配，是因为其中使用了高浓度的载体两性电解质(CAs)。三 年前本专利技术人报道了一种无须在样品中添加自由载体两性电解质的毛细管等电聚焦方法，其 中使用了整体型固定化pH梯度技术，载体两性电解质分子通过共价键固定于聚合物表面，但 不失其酸碱两性及缓冲能力。在聚焦时非挥发性的离子被赶出柱子，而载体两性电解质分子 在聚焦完成后并不随蛋白质一起迀移出毛细管，因此被分离的蛋白质区带可以直接导入质谱 仪进行检测。为了分离复杂的生物样品，专利技术人还开发了窄梯度的整体型固定化pH梯度，其 分辨率更高，可以进一步分离在宽整体型固定化PH梯度上不能分开的蛋白质谱带。毛细管等电聚焦对两性电解质尤其是蛋白质及肽具有很高的分辨率。为了在毛细管中建 立适宜的pH梯度，CIEF缓冲溶液中加入较高浓度的CAs，这限制了CIEF的应用范围。使用 CAs带来的问题主要表现在下列几个方面(1) CAs本身是复杂混合物，不同批次的产品会有差异，将导致分离重现性降低；(2) 自由溶液中CAs建立的pH梯度不够稳定，会发生负极漂移现象，漂移使负极端的梯 度平坦化，导致在极端(>9) pH条件下分辨率降低；(3) CAs有强烈的紫外吸收，直接导致短波范围检测波长不能使用，这会降低紫外-可见检测器吸收灵敏度，实验当中往往只能选择280nm作为检测波长；(4) 质谱是蛋白质表征和鉴定的重要手段，高浓度两性电解质CAs的使用会增大质谱仪 噪音，限制了CIEF与质谱仪的联用；(5) CAs价格昂贵，作为高浓度使用的消耗品会增加实验成本。 在CIEF中，无需CAs而进行聚焦的技术也曾经有过报道，比如流体聚焦(rheoelectrolysis)、电解水、热致pH梯度、自聚焦(auto-focusing)等，但尚存在梯度 不够稳定、分辨率低、所需仪器设备太复杂等各种缺点。显然，与IPG的功效类似，如果将pH梯度固定到柱管中，可以解决CAs带来的部分问题。 1986年Hochstrasser等(参考文献 Hochstrasser D. ， Augsburger V. ， Funk M. ， Appel R.， Pellegrini C.， Muller A. F. Immobilized pH gradients in capillary tubes and two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 1986， 7: 505-511)介绍了^■ 禾中"载体两性电解质一固定化pH梯度"(CA—IPG， carrier ampholyte—immobilized pHgradient)，他们把商品化CAs (LKB)加入聚丙烯酰胺中制成凝胶，并使其在内径为 1.5mm的玻璃管中成型，制成的pH梯度分离介质用于2D PAGE处理人血清样品，显示出一定的 效果。然而作者也承认，在使用高电压的情况下该"固定化"梯度有可能从负极端逸出玻璃 管，导致系统短路的危险。Klein等人(参考文献Klein J. ， Harding G. ， Klein E. A new isoelectric focusing gel for two-dimensional electrophoresis constructed in microporous hollow fiber membranes. J Proteom. Res. 2002， 1: 41—45)在不浸润的微 孔塑料管中制备IEF胶，利用商品化的CAs (pH 3 10)，可制得4. 5 9. 5梯度的分离介质。 但上述两种方法只是将CAs引入凝胶，CAs并未通过化学键固定在凝胶上，并且也未将凝胶固 定于管壁，因此其稳定性并不理想。一种新型的在毛细管中制备整体柱型固定化pH梯度(M-IPG, monolithic immobilized pH gradient) 的方法(参考文献Chun Yang, Guijie Zhu， Weibing Zhang, Yukui Zhang"Repeatedly usable immobilized pH gradient in a monolithic capillary column" Electrophoresis 2004， 25: 1729-1734)通过在整体基质表面化学键合CAs的方法实现，制 备的材料可以方便地实现蛋白质混合物的等电聚焦分离，该方法还可以实现窄梯度的M-IPG(参考文献Guijie Zhu， Chun Yang, 匕ihua Zhang, Weibing Zhang, Yukui Zhang " Optimization of the preparation of monolithic immobilized pH gradient and a method to make narrow gradients" Talanta 2006， 70， 2-6)。但目前M-IPG的缺点是必 须使用商品化的CAs。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种整体型固定化PH梯度的制备方法及其应用。本专利技术针对现 有M-IPG的缺点，提供了一种可实现l 14任意制定范围的高分辨率pH梯度的制备方法，以及 这种pH梯度在等电聚焦分离两性电解质中的应用。本专利技术是这样实现的 一种整体型固定化PH梯度的制备方法为(1)配制一系列由酸 、碱以及中性单体组成的具有不同PH值的溶液，每种溶液至少含有3种单体酸性单体 AiA2C=CA3A4、碱性单体BiB2C《B3B4、中性单体&&0《&&，其余成分为溶剂、致孔剂、引发 剂中的一种或多种；溶液中单体A"2C《A3A4、 BiB2C《B3B4的浓度呈现梯度分布；(2)每一 种溶液聚合得到一个pH梯度，多个梯度组合得到宽范围的pH梯度，采用原位本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种整体型固定化ｐＨ梯度的制备方法，其特征在于：（１）配制一系列由酸、碱以及中性单体组成的具有不同ｐＨ值的溶液，每种溶液至少含有３种单体：酸性单体Ａ１Ａ２Ｃ＝ＣＡ３Ａ４、碱性单体Ｂ１Ｂ２Ｃ＝ＣＢ３Ｂ４、中性单体Ｎ１Ｎ２Ｃ＝ＣＮ３Ｎ４，其余成分为溶剂、致孔剂、引发剂中的一种或多种；溶液中单体Ａ１Ａ２Ｃ＝ＣＡ３Ａ４、Ｂ１Ｂ２Ｃ＝ＣＢ３Ｂ４的浓度呈现梯度分布；（２）每一种溶液聚合得到一个ｐＨ梯度，多个梯度组合得到宽范围的ｐＨ梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法将ｐＨ梯度固定在柱形容器中，即得整体型固定化ｐＨ梯度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨春，
申请(专利权)人：杨春，
类型：发明
国别省市：52[中国|贵州]
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