双拷贝gC基因的重组伪狂犬病毒TK/gI/gE缺失株及其构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双拷贝gC基因的重组伪狂犬病毒TK/gI/gE缺失株，是在伪狂犬重组病毒PRV‑AH‑gE

【技术实现步骤摘要】
双拷贝gC基因的重组伪狂犬病毒TK/gI/gE缺失株及其构建和应用
本专利技术涉及猪伪狂犬弱毒活疫苗
，更具体地，涉及一株双拷贝gC基因的重组伪狂犬病毒TK/gI/gE缺失株及其构建和应用。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种急性传染病，主要临床症状有发热、神经系统症状、呼吸道症状等。PRV除了可以感染猪、牛、绵羊、犬和猫以外，多种野生动物也能感染该病，其中猪是PRV的自然宿主。到目前为止伪狂犬病没有有效的药物，疫苗接种依然是预防和控制伪狂犬病的有效手段。国内外已研制的疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗和基因缺失苗。由于早期国内外用的灭活疫苗和弱毒疫苗都会存在一些缺点，加上基因编辑技术的逐渐成熟，所以基因工程疫苗成为了研究的热点。1990年之后国内大规模应用PRV基因缺失疫苗，除个别地区偶发外，总体上疫情得到有效控制。但自2011年以来，在河南、河北、江苏等20多个省出现了新的伪狂犬病疫情。据报道，很多免疫过Bartha-k61株基因缺失疫苗的猪场也出现了疫情，说明了国一直使用的弱毒gE/gI双缺失的Bartha本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双拷贝gC基因的重组伪狂犬病毒TK/gI/gE缺失株，其特征在于，是在伪狂犬重组病毒PRV-AH-gE

【技术特征摘要】
1.一种双拷贝gC基因的重组伪狂犬病毒TK/gI/gE缺失株，其特征在于，是在伪狂犬重组病毒PRV-AH-gE-/gI-缺失株上再缺失部分TK基因，同时在gE/gI基因缺失位置处插入gC基因后得到；所述缺失的部分TK基因序列如SEQIDNO:1所示；所述gC基因序列如SEQIDNO:2所示。


2.权利要求1所述的双拷贝gC基因的重组伪狂犬病毒TK/gI/gE缺失株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.根据PRVZJ01株基因序列，以伪狂犬病毒变异株PRVAH-China-2013株为模板，设计2对引物TK-LA1-F/R与TK-RA1-F/R，分别扩增位于TK基因两侧的可用于同源重组的左臂片段LA1和右臂片段RA1；再与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMD-LA1-RA1(TK)；
S2.以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物Sosoo-EGFP-F/R扩增EGFP表达盒，构建表达EGFP的转移质粒pMD-LA1-EGFP-RA1(TK)；
S3.将步骤S2制得的重组质粒pMD-LA1-EGFP-RA1(TK)转染BHK-21细胞，然后接种PRV-AH-gE-/gI-缺失株，通过筛选发荧光重组病毒，获得rPRV-AH-Tk-/gI-/gE-/EGFP+(TK)毒株；运用相同方法，以rPRV-AH-gI-/gE-/EGFP+(TK)为亲本毒株和质粒pMD-LA1-RA1(TK)发生同源重组并筛选不发荧光重组病毒，获得rPRV-AH-TK-/gI-/gE-毒株；
S4.以pEGFP-N1为模板，扩增EGFP表达盒，构建pMD-LA-EGFP-RA(gE)质粒；将rPRV-AH-TK-/gI-/gE-毒株和质粒pMD-LA-EGFP-RA(gE)发生同源重组，然后筛选并获得rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/EGFP+(gE)毒株。
S5.以重组质粒pgC-N1为模板，设计引物Sosoo-gC-F/RPCR扩增PCMV-gC-SV40polyA表达盒，插入转移质粒pMD-LA-RA(gE)，构建质粒pMD...

【专利技术属性】
技术研发人员：琚春梅，陈美静，何淑菲，颜志斌，吴晓燕，纪秋云，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44