一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用，属于人源单克隆抗体领域。本发明专利技术在B95.8细胞中加入PMA进行孵育处理，然后培养，离心得高滴度EB病毒。再利用高滴度EB病毒结合辐照的饲养层细胞和CpG共同孵育实现记忆性B细胞的永生化，然后利用永生化记忆性B细胞分泌的抗体快速筛选病原特异性抗体和中和性抗体。实现有针对性的快速筛选、获得有结合活性或有中和活性的全人源单克隆抗体，减少后续无关抗体基因扩增和验证的庞大工作量，而且可以在筛选早期就确定抗体是否有结合活性或中和活性，可以快速集中进行中和抗体的制备，减少了不必要的盲目表达验证，提高了特异性快速筛选抗体的过程。

【技术实现步骤摘要】
一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用
本专利技术涉及人源单克隆抗体领域，具体地，涉及一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用。
技术介绍
机体的免疫反应包括体液免疫和细胞免疫，共同协同发挥作用，抵御病原的入侵；其中体液免疫主要通过抗体-抗原结合识别、抑制病原在体内的复制，而中和性抗体是目前治疗病毒性传染病的重要方法，如呼吸道合胞体病毒(RSV)的商业化抗体帕利珠单抗(Palivizumab,Synagis)是一种人源化鼠抗RSV单克隆中和抗体，抗炭疽杆菌的瑞西巴库单抗(Raxibacumab,ABthrax)是美国食品药品管理局(FDA)批准的全人源抗炭疽芽孢杆菌毒素的单克隆抗体；全人源中和性单克隆抗体是目前临床救治发展最快的药物之一。目前人源单克隆抗体的制备方法中，有利用鼠源抗体人源化、噬菌体展示文库筛选、酵母展示文库筛选、单细胞RT-PCR等方法；鼠源抗体人源化主要指恒定区和可变区的框架区人源化，制备获得的抗体可变区仍然是针对小鼠的免疫系统，无法做到全人源化，仍有免疫排斥的可能性；噬菌体和酵母展示文库方法都是通过构建庞大的可变区文库，筛选有结合的抗体，但重链轻链的组合是随机的，可能会产生某些机体不存在的抗体组合方式，生物影响未知，另外这种方法筛选工作量较大，针对性不强；单细胞RT-PCR是通过流式分选获得单个特异性可与病原蛋白结合的B细胞，然后提取核酸、扩增、表达抗体。该方法只能通过特异性探针捕捉特异性B细胞，工作量较大，无法在早期筛选时确认中和性抗体，只有抗体表达后才能确认，工作量较大。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种高滴度EB病毒的制备方法、EB病毒永生化记忆性B细胞的方法与应用。本专利技术的第一个目的是提供一种高滴度EB病毒及其制备方法；本专利技术的第二个目的是提供一种EB病毒永生化记忆性B细胞的方法；本专利技术的第三个目的是提供EB病毒永生化记忆性B细胞用于筛选具有结合活性或中和活性的人源单克隆抗体。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。一种高滴度EB病毒的制备方法，包括以下步骤：在经过传代培养的B95.8细胞中加入PMA进行孵育处理，然后继续培养，离心得高滴度EB病毒。优选的，当B95.8细胞传代培养的浓度为(5～10)×105cell/ml时，加入PMA。进一步优选的，当B95.8细胞传代培养的浓度为5×105cell/ml时，加入PMA。优选的，所述PMA是以溶解于乙醇中的方式加入，PMA加入后在培养基中的浓度为5～10ng/ml。进一步优选的，所述PMA是以溶解于乙醇中的方式加入，PMA加入后在培养基中的浓度为5ng/ml。优选的，所述孵育处理的时间为12～24h。进一步优选的，所述孵育处理的时间为24h。优选的，继续培养的时间为10～15天。进一步优选的，继续培养的时间为10天。由以上所述的制备方法制得的一种高滴度EB病毒，该EB病毒的浓度为1×109copies/ml以上。利用以上所述的高滴度EB病毒永生化记忆性B细胞的方法，包括以下步骤：(1)利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，然后对所得淋巴细胞进行辐照，获得饲养层细胞；(2)将所述高滴度EB病毒、所述饲养层细胞、记忆性B细胞、CpG以及培养基混合，再转入细胞培养板中培养，得EB病毒永生化记忆性B细胞。优选的，步骤(1)所述辐照的剂量为2000～3000rads。进一步优选的，步骤(1)所述辐照的剂量为3000rads。优选的，步骤(2)中，所述EB病毒在培养基中的浓度为(1～5)×107copies/ml。优选的，步骤(2)中，所述饲养层细胞在细胞培养板中的浓度为(1～5)×104cells/well。进一步优选的，所述饲养层细胞在细胞培养板中的浓度为1×104cells/well。优选的，步骤(2)中，所述记忆性B细胞在细胞培养板中的浓度为1～3cells/well。进一步优选的，所述记忆性B细胞在细胞培养板中的浓度为3cells/well。优选的，步骤(2)中，所述CpG在培养基中的浓度为1.25～2.5μg/ml。进一步优选的，所述CpG在培养基中的浓度为2.5μg/ml。优选的，步骤(2)所述培养的时间为12～14天。优选的，步骤(2)所述细胞培养板为384孔细胞培养板。以上所述的方法应用于筛选具有结合活性或中和活性的人源单克隆抗体。优选的，以上所述的方法在中东呼吸综合征冠状病毒人源中和性抗体开发中的应用。本专利技术利用PMA(佛波醇肉豆蔻酰乙酸酯)刺激B95.8细胞分泌EB病毒，并通过蔗糖垫底超速离心富集获得高滴度EB病毒，B95.8为狨猴EB病毒转化的B细胞系，可释放高滴度的EB病毒，PMA是一种具有潜在促癌作用的佛波酯，可刺激B95.8分泌高滴度的EB病毒，建立EB病毒绝对荧光定量核酸检测方法，确定EB病毒的滴度(即每毫升病毒拷贝数)。利用B95.8细胞、PMA和超速离心富集和荧光定量最终获得已知浓度的高滴度EB病毒。利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后用辐照仪进行辐照，制备获得无法增殖的饲养层细胞。淋巴细胞分离液利用红细胞和淋巴细胞的密度存在差异，而淋巴分离液的密度介于两者之间，然后通过离心可以分离获得较纯的淋巴细胞；适当剂量的辐照可以使PBMC不再增殖，慢慢凋亡，辐照的PBMC作为饲养层细胞可以为磁珠分选的记忆B细胞提供增殖的环境，有利于永生化的记忆B细胞不断增殖。EB病毒永生化记忆性B细胞过程，将制备的EB病毒与饲养层细胞和磁珠分选获得记忆B细胞以及CpG混合，转入384孔细胞培养板连续培养；CpG是一种硫代修饰的寡核苷酸，可以刺激记忆性B细胞活化，促进记忆性B细胞的永生化。结合抗体和中和性抗体筛选：经过12-14天培养永生化的记忆B细胞会分泌相应的抗体，收取384孔上清进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒的中和实验，可以快速筛选哪些孔的细胞分泌病毒特异性人源抗体以及哪些抗体是具有中和性的。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：本专利技术首次提出制备高滴度的EB病毒方法，利用高滴度EB病毒结合辐照的饲养层细胞和CpG共同孵育实现记忆性B细胞的永生化，然后利用永生化记忆性B细胞分泌的抗体快速筛选病原特异性抗体和中和性抗体。实现有针对性的快速筛选、获得有结合活性或有中和活性的全人源单克隆抗体，减少后续无关抗体基因扩增和验证的庞大工作量，而且可以在筛选早期就确定抗体是否有结合活性或中和活性，可以快速集中进行中和抗体的制备，减少了不必要的盲目表达验证，提高了特异性快速筛选抗体的过程。附图说明图1为EB病毒永生化记忆性B细胞筛选人源单克隆抗体的路线图；图2a、图2b为建立EB病毒核酸荧光定量检测方法过程中标准品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高滴度EB病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n在经过传代培养的B95.8细胞中加入PMA进行孵育处理，然后继续培养，离心得高滴度EB病毒。/n

【技术特征摘要】
20190710 CN 20191062195701.一种高滴度EB病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在经过传代培养的B95.8细胞中加入PMA进行孵育处理，然后继续培养，离心得高滴度EB病毒。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当B95.8细胞传代培养的浓度为（5~10）×105cell/ml时，加入PMA；所述PMA是以溶解于乙醇中的方式加入，PMA加入后在培养基中的浓度为5~10ng/ml。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孵育处理的时间为12~24h，继续培养的时间为10~15天。


4.由权利要求1-3任一项所述的制备方法制得的一种高滴度EB病毒，其特征在于，EB病毒的浓度为1×109copies/ml以上。


5.利用权利要求4所述的高滴度EB病毒永生化记忆性B细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，然后对所得淋...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵金存，王延群，肇静娴，李昕，甘棉，张璐，张昭勇，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44