一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体及透皮制剂与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体及透皮制剂与应用，所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体提取液为2至5代人脐带间充质干细胞经培养后富集所得；所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体内中包裹的番茄红素；所述番茄红素的包裹浓度为20至100ng/mL；工程化人脐带间充质干细胞外泌体透皮制剂包括药学上可接受的透皮载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为上述的外泌体。通过番茄红素与工程化人脐带间充质干细胞外泌体共同作用于皮肤细胞，使外泌体促进下新生成的表皮、真皮层细胞具有更好的细胞状态，达到改善肤质，阻止皮肤细胞衰老，恢复皮肤正常结构和生理功能，改善皮肤状态功效。

【技术实现步骤摘要】
一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体及透皮制剂与应用
本专利技术属于细胞生物学、分子生物学及药物研发
，尤其是涉及一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体及其透皮制剂与应用。
技术介绍
如何延缓和阻止皮肤细胞的衰老是皮肤美容抗衰老的根本问题。随年龄增长，皮肤基底细胞分裂能力逐渐降低，皮肤生长因子水平降低，作用减弱，细胞凋亡随年龄增长而增加，成纤维细胞逐渐减少，成纤维细胞分泌的胶原蛋白也在逐渐减少，从而表现出皮肤的弹性降低、出现皱纹等现象。目前，市面上的外用化妆品一般只是通过遮掩缺陷或是在皮肤表层起作用来达到美容目的，但仅是治标，缺不能达到真正激活皮肤的治本效果。番茄红素是一种强抗氧化剂，具有猝灭单线态氧和清除自由基的生理功能。对护肤来说，番茄红素可淬灭表皮细胞中的自由基，对老年色斑有明显的褪色作用；还可对抗UV，避免晒伤产生红斑，减轻UV损伤。然而由于它是一种脂溶性的类胡罗卜素，在水中不溶解，在光、热氧的作用下很容易被氧化降解，这就大大限制其化妆品等领域中的应用，尤其是作为护肤品，其无法逾越皮肤角质层屏障，难以皮肤的吸收和利用。干细胞(StemCells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。随着干细胞的功能不断被发现，干细胞在生命科学的基础研究与临床应用中起着越来越重要的作用，干细胞在细胞治疗、组织器官修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景。间充质干细胞(MesenchymalStromalCells，MSCs)是干细胞的一个研究分支，间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSCs最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。研究表明，间充质干细胞一个强大的功能就是分泌众多的营养性细胞因子。现在越来越多的研究倾向于认为间充质干细胞主要通过旁分泌机制来分泌多种细胞因子作用于其他细胞来发挥作用。外泌体是一种直径在30至100nm的脂质双分子层囊泡，最早在1983年研究羊的网织红细胞成熟过程中分泌的囊泡而提出，其可携带细胞特异表达的蛋白、脂质和核酸等物质，然后通过与细胞的接触直接将所携带的物质传递给邻近或者远距离的细胞。目前大量研究表明，间充质干细胞来源的外泌体可以通过其内容的蛋白、RNA成分胞间转移，发挥与间充质干细胞相类似的组织修复、免疫抑制、调节免疫功能等作用。相对于细胞治疗，外泌体具有性质稳定，保存运输方便，无免疫排斥反应和肿瘤形成风险等，有望成为一种新的生物治疗策略。因此如何取得能够针对性促进表皮和真皮层细胞(特别是成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞)增殖、分裂、分化，新生细胞增多，使皮肤增厚，逐渐恢复皮肤正常结构和生理功能；同时促进胶原纤维、网状纤维、弹性纤维的形成，调节胶原蛋白和粘多糖的分泌，维持皮肤组织中水分含量和电解质代谢，改善萎缩皮肤的缺水状态，滋润皮肤组织的间充质干细胞外泌体，并且如何将其应用于皮肤表面，安全、高效的延缓和阻止皮肤细胞的衰老，成为当前的研究重点。而同时药物透皮输送系统可以有效地避免胃肠道的首过效应，使药物直接通过庞大的真皮下毛细血管网直接进入体循环发挥药效。皮肤的角质层是限制药物透过的主要屏障，其主要有凋亡的细胞和脂质构成，大量的研究已经证实脂类物质很容易穿透该层到达真皮层。纳米脂质载体(NanostructuredLipidCarriers，NLC)是不同于霜剂、乳剂、亚微乳、微乳(O/W型、W/O型以及W/O/W型)、凝胶、脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒(SolidLipidNanoparticles，SLN)的一种药物载体，相对于这些剂型来说，纳米脂质载体能装载更多的药物成分，储存期能更牢固的将活性成分包裹在粒子基体内。通过使用分子结构完全不同的脂质混合物来制备粒子，粒子内部形成大量不规则空间，从而限制了所载药物的自由移动，大大减少了粒子在存放过程中药物泄露的现象。由于纳米脂质载体的材料是由脂质构成，与皮肤层具有很好的相容性，如果通过特定技术制备小于200nm的脂质粒子，它可能会很好地通过皮肤屏障进入血液循环，可能会避免胃肠道给药对药物或活性成分的首过效应。
技术实现思路
本专利技术目的在克服现有技术缺陷，提供一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体及其透皮制剂与用途，克服番茄红素无法逾越皮肤角质层屏障，难以皮肤的吸收和利用等问题。具体技术方案为：提供一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体，所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体提取液为2至5代人脐带间充质干细胞经培养后富集所得；所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体内中包裹的番茄红素；所述番茄红素的包裹浓度为20至100ng/mL。还提供一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，步骤一、脐带间充质干细胞培养保存：脐带由无菌储液瓶采集、运输，保存、运送温度维持4℃；步骤二、脐带间充质干细胞培养分离：将脐带清洗后，修剪，再次洗净至上清无血色；将洗净的脐带去除外皮后，进行切块和贴壁培养；每隔3天换培养基，直至有间充质干细胞爬出；步骤三、收集间充质干细胞：爬出间充质干细胞在漂洗，用消化酶消化细胞后，离心，弃上清，收集沉淀细胞种到细胞瓶中；收集到的细胞进行传代培养；步骤四、收集外泌体：选取细胞状态较好的2至5代间充质干细胞培养后，富集培养上清液，离心取上清液进行滤膜过滤，置于4℃环境备用；步骤五、鉴定外泌体：取收集外泌体溶液经3％磷钨酸溶液负染后，通过透射电镜观察形态进行鉴定。还提供一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体包裹番茄红素的方法：获取人间充质干细胞源外泌体提取物、番茄红素溶液，二者的重量比为1:10-20；步骤为：按比例称取所述人间充质干细胞源外泌体提取物、番茄红素，利用超声、电转或挤压中的其中一种或多种方式使番茄红素包裹入外泌体中，然后依次经0.45μm、0.22μm的微孔滤膜过滤，即得到包裹番茄红素的外泌体。更提供一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体透皮制剂，包括药学上可接受的透皮载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为上述的外泌体。作为优选的，所述透皮载体为纳米、脂质载体中的一种或多种。还提供一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体透皮制剂的应用，所述制剂的给药方式为透皮给药。作为优选的，包括以下用途中的一种或几种：A作为制备预防皮肤色斑治疗药物或化妆品的应用；B作为制备皮肤抗衰老药物或化妆品的应用；C作为制备治疗皮肤UV晒伤药物或化妆品的应用。有益效果：1.脐带间充质干细胞取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题，极其适合于临床研究和应用。2.取2至5代的人脐带间充质干细胞，采用无血清培养使细胞处于饥饿状态，再加入表皮细胞生长因子诱导，培养至细胞处于对数生长期，能够有效诱导人脐带间充质干细胞大量合成和分泌具有针对性促进表皮和真皮层细胞(特别是成纤维细胞、上皮细胞、内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：/n所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体提取液为2至5代人脐带间充质干细胞经培养后富集所得；/n所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体内中包裹的番茄红素；所述番茄红素的包裹浓度为20至100ng/mL。/n

【技术特征摘要】
1.一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体，其特征在于：
所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体提取液为2至5代人脐带间充质干细胞经培养后富集所得；
所述工程化人脐带间充质干细胞外泌体内中包裹的番茄红素；所述番茄红素的包裹浓度为20至100ng/mL。


2.一种工程化人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：
步骤一、脐带间充质干细胞培养保存：脐带由无菌储液瓶采集、运输，保存、运送温度维持4℃；
步骤二、脐带间充质干细胞培养分离：将脐带清洗后，修剪，再次洗净至上清无血色；将洗净的脐带去除外皮后，进行切块和贴壁培养；每隔3天换培养基，直至有间充质干细胞爬出；
步骤三、收集间充质干细胞：爬出间充质干细胞在漂洗，用消化酶消化细胞后，离心，弃上清，收集沉淀细胞种到细胞瓶中；收集到的细胞进行传代培养；
步骤四、收集外泌体：选取细胞状态较好的2至5代间充质干细胞培养后，富集培养上清液，离心取上清液进行滤膜过滤，置于4℃环境备用；
步骤五、鉴定外泌体：取收集外泌体溶液经3％磷钨酸溶液负染后，通过透射电镜观察形态进行鉴定。


3.根据权利要求1或2所述的一种工程化人脐带间充质干细胞外泌...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓广文，吴曙霞，李玉霞，谢创丰，
申请(专利权)人：艾一生命科技广东有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44