一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法技术

本发明专利技术公开了一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，包括以下步骤：在干细胞培养基内加入预设量的牛血清，再额外加入预设浓度的牛血清外泌体。本发明专利技术所提供的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，优化了干细胞培养条件，能够改善干细胞的生长状态。在不需要提高牛血清加入量的情况下，能够增加牛血清外泌体的含量，为干细胞生长提供更多的活性成分及营养物质。同时不会引入过多油脂、激素、抗生素等杂质因子，减少对干细胞的影响。另外，通过额外加入牛血清外泌体，能够减少因牛产地不同、牛血清分离工艺不同、牛血清批次不同等因素造成的牛血清差异，有利于干细胞的稳定培养。有利于干细胞的稳定培养。有利于干细胞的稳定培养。

【技术实现步骤摘要】
一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一种成体干细胞，它存在于脐带、骨髓、脂肪和脐带血等一些组织中，具有很强的自我更新及多胚层分化能力。研究表明间充质干细胞在免疫调节和促进组织修复方面疗效显著，其已经大量用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、移植物抗宿主病、肝纤维化等多种重大疾病的临床研究和治疗上。脐带间充质干细胞是从足月分娩断脐后的新生儿脐带中提取，具有来源丰富、不伤及身体、增殖能力强、具有多胚层分化能力、免疫原性低等优点，已经得到了越来越多专业人士的认可和应用。
[0003]在脐带干细胞培养时，一般会选用DMEM培养基作为基础培养基，然后添加一定浓度的牛血清(5％
‑
15％不等)。现有培养方法中，当牛血清添加比例太少时，细胞生长和贴壁状态不好。而当提高牛血清浓度时，牛血清中含有的油脂、激素、抗生素等杂质小分子物质的含量也会提高，一方面这些杂质小分子的具体含量和功能不确定，另一方面，油脂会使细胞代谢产物谱发生变化及可导致补体含量的提高，激素会加速干细胞分化，这些因素均不利于细胞的培养。此外，这些杂质因子会屏蔽牛血清中活性成分的功能。且牛产地不同、牛血清分离工艺不同、牛血清批次不同等因素均会导致不同牛血清之间的差异，这些不稳定的因素不利于干细胞的稳定培养。
[0004]也就是说，现有的用牛血清进行干细胞培养时存在以下缺陷：(1)牛血清浓度低时，细胞生长和贴壁不好；牛血清浓度高时，会带入更多的血清杂质因子，影响细胞培养；(2)不同牛血清具体成分差异较大，不利于干细胞稳定培养。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，优化了干细胞培养条件，能改善干细胞的生长状态。
[0006]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0007]一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，包括以下步骤：在干细胞培养基内加入预设量的牛血清，再额外加入预设浓度的牛血清外泌体。
[0008]进一步地，牛血清的加入量为所述干细胞培养基用量的3～10％；额外加入的牛血清外泌体在所述干细胞培养基中的浓度为1.0
×
108～1.0
×
109particals/mL。
[0009]进一步地，所述牛血清外泌体为采用试剂盒提取获得的外泌体。
[0010]进一步地，所述牛血清为胎牛血清，所述牛血清外泌体为胎牛血清外泌体。
[0011]进一步地，所述干细胞为间充质干细胞，优选地为脐带间充质干细胞。
[0012]进一步地，采用组织培养法进行干细胞培养。
[0013]进一步地，在干细胞的原代培养中额外加入预设浓度的牛血清外泌体；或，在干细胞的传代培养中额外加入预设浓度的牛血清外泌体。
[0014]进一步地，包括以下步骤：将组织块接种在培养容器中，向所述培养容器中添加干细胞培养液，再额外加入牛血清外泌体，额外加入的牛血清外泌体在所述干细胞培养液中的浓度为1.0
×
108～1.0
×
109particals/mL；然后将培养容器置于培养箱中培养，培养过程中每次更换培养液时，都在培养液中额外加入相同浓度的牛血清外泌体。
[0015]进一步地，所述组织块为脐带华通氏胶；所述干细胞培养液为含5％血清的DMEM/F12无酚红培养液；所述培养容器为培养皿，将所述培养皿放置于37℃、5％CO2的培养箱静置培养，培养过程每48
‑
72小时更换一次培养液，每次换液时都在培养液中额外加入相同浓度的牛血清外泌体。
[0016]进一步地，培养过程每48
‑
72小时进行一次传代培养。
[0017]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0018]本专利技术所提供的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，优化了干细胞培养条件，能够改善干细胞的生长状态。在不需要提高牛血清加入量的情况下，能够增加牛血清外泌体的含量，为干细胞生长提供更多的活性成分及营养物质。同时不会引入过多油脂、激素、抗生素等杂质因子，减少对干细胞的影响。另外，通过额外加入牛血清外泌体，能够减少因牛产地不同、牛血清分离工艺不同、牛血清批次不同等因素造成的牛血清差异，有利于干细胞的稳定培养。
附图说明
[0019]图1为本专利技术实施例所提供的试剂盒提取的牛血清外泌体的电镜形态图和UC方法提取的外泌体的电镜形态图；
[0020]图2为本专利技术实施例所提供的试剂盒提取的牛血清外泌体的粒径分布图；
[0021]图3为本专利技术实施例1所提供的培养方法培养13天后的原代细胞生长状态图；
[0022]图4为本专利技术实施例2所提供的培养方法培养13天后的原代细胞生长状态图；
[0023]图5为本专利技术实施例3所提供的培养方法传代培养3天后的细胞生长状态图。
具体实施方式
[0024]下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
[0025]一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，包括以下步骤：在干细胞培养基内加入预设量的牛血清，再额外加入预设浓度的牛血清外泌体。其中，牛血清优选为胎牛血清，牛血清外泌体优选为胎牛血清外泌体；干细胞为间充质干细胞，优选地为脐带间充质干细胞。在进行细胞培养时，可以采用组织培养法。
[0026]血清外泌体是血清中的核心活性成分，直径在40
‑
100nm左右，富含与细胞膜相同的磷脂双分子层薄膜结构，表面含有特异性蛋白质、细胞因子、生长因子等，其包裹蛋白质、脂质、miRNA片段，可通过生物膜屏障，定位细胞损伤区域。本专利技术实施例的牛血清外泌体来源于牛血清，去除掉血清中会对细胞生长产生不利影响的激素等其他杂质，再将作为活性
成分的牛血清外泌体额外添加到干细胞的基础培养基中，包括的优势有：
[0027]1、胎牛血清是通过母牛剖腹产胎牛时，心脏密闭穿刺采血获得的新鲜胎牛全血经自然层析、离心后收集得到的，且去除了血细胞、纤维蛋白等成分的淡黄色透明上清液体，后经多级高置流膜过滤技术和三级终端微滤方法处理。外泌体来源为胎牛血清，商业化程度高，商品化的血清中不含病毒成分，血清提取工艺稳定，质量稳定。
[0028]2、外泌体来源于胎牛的血液。胎牛血所含有的细胞来源种类丰富，包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、肝干细胞等多种具有高活性、处于不同发育阶段、来自不同胚层的、具备复合功能状态的细胞。因为胎牛血清的外泌体来自上述细胞，所以胎牛血清中的外泌体具有和上述细胞相关的发育必须的生物学活性。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：在干细胞培养基内加入预设量的牛血清，再额外加入预设浓度的牛血清外泌体。2.如权利要求1所述的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，其特征在于，牛血清的加入量为所述干细胞培养基用量的3～10％；额外加入的牛血清外泌体在所述干细胞培养基中的浓度为1.0
×
108～1.0
×
109particals/mL。3.如权利要求1所述的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，其特征在于，所述牛血清外泌体为采用试剂盒提取获得的外泌体。4.如权利要求1所述的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，其特征在于，所述牛血清为胎牛血清，所述牛血清外泌体为胎牛血清外泌体。5.如权利要求1所述的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，优选地为脐带间充质干细胞。6.如权利要求1所述的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，其特征在于，采用组织培养法进行干细胞培养。7.如权利要求1所述的牛血清外泌体用于干细胞培养的方法，其特征在于，在干细胞的原代培养中额外加入预设浓度的牛血清外泌体；或...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉霞，刘澎，孙琦，谢利莹，
申请(专利权)人：艾一生命科技广东有限公司，
类型：发明
国别省市：