用于活体单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了属于单细胞刺激技术领域的一种用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置。该装置包括芯片对准装置、细胞样品操控平台及流动注射泵；细胞样品置于所述样品操控平台上，微流控芯片固定在芯片对准装置上，利用对准装置将芯片悬于操控平台上方，对准目标细胞的特定位置；利用流动注射泵驱动芯片内流体，芯片出口处将形成稳定的层流分布，流体交汇于微米区域中，反应物在微米区域中原位反应产生新鲜的自由基物质，对处在该区域的细胞局部结构进行定点轰击。本发明专利技术采用原位产生活性自由基的方式，实现了对单细胞局部微区的自由基刺激操作，可用于其他活性物质的原位产生反应，为研究单细胞的响应行为打下重要基础。

【技术实现步骤摘要】
用于活体单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置
本专利技术属于单细胞刺激
，特别涉及一种用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置。
技术介绍
作为生命体的基本组成单元，细胞的主要特征是能对外界刺激做出响应，这种响应将会反映出细胞的独特性质。传统的研究中细胞通常受到的是整体的生化刺激，而局部的刺激则更有利于细胞性质的展现，比如细胞局部区域被切割后能展露出其自修复性质。因此，研究细胞在局部刺激下的响应性质对于生命科学的发展有着重要的意义。自由基是一种体内常见的活性中间体，尽管它们浓度低、寿命短，但活性极高，能够破坏蛋白质、脂质、多糖、核酸等绝大多数生物分子。过量产生的自由基将会对细胞造成毁灭性打击，诱发癌变、哮喘、帕金森等多种疾病。研究自由基刺激对于细胞的作用将有助于人们更加深入地了解自由基的危害，探索抵御该危害的方法。然而由于自由基极不稳定，制备出来后难以保存和应用，从而难以用于细胞刺激，导致相关研究领域仍有空白。因而发展一种能用于单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控技术显得十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置，其特征在于：该装置包括芯片对准装置、细胞样品操控平台及流动注射泵；细胞样品置于所述样品操控平台上，微流控芯片固定在芯片对准装置上，利用对准装置将芯片悬于操控平台上方，对准目标细胞的特定位置；利用流动注射泵驱动芯片内流体，芯片出口处将形成稳定的层流分布，所注入的流体交汇于微米区域中，反应物在微米区域中原位反应产生新鲜的自由基物质，进而对处在该区域的细胞局部结构进行定点轰击。所述芯片对准装置包括XYZ位置控制平台和微流控芯片，所述微流控芯片固定于所述XYZ位置控制平台上，以此操控芯片在三维方向上的运动。所述微流控芯片有三根平行通道，边缘的两个通道注入不同反应试剂，中间的通道进行培养皿中液体(包括培养皿中已存在的环境溶液及所注入的反应试剂溶液)的抽取。所述细胞样品操控平台包括电控载物台、培养皿、细胞培养缓冲液、细胞样品和显微镜物镜；在电控载物台上放置培养有细胞样品的培养皿，细胞上层覆盖细胞培养缓冲液；显微镜物镜位于电控载物台下方，用于对细胞进行观察和定位。所述电控载物台为含有温度控制器的XY位置控制平台，用来控制样品温度在36℃-38℃并操控样品在XY方向上的运动。所述微流控芯片垂直置于培养皿上方，插入细胞培养缓冲液的液面下；在显微镜的观察下，通过XYZ位置控制平台调整微流控芯片至目标位置；通过电控载物台的移动调整细胞样品，使目标细胞位于微流控芯片中间通道出口的正下方目标位置，并通过调整XYZ位置控制平台来控制芯片底端与样品的距离。所述流动注射泵采用商用流动注射泵；该流动注射泵采用Pump11Elite哈佛流动注射泵，用以驱动微流控芯片内流体(包括所要注入的反应试剂溶液及抽取的培养皿中的液体)的运动；并调整流速至合适的值，使所注入的反应物交汇在微米级别区域内，进而通过生化反应原位产生所需的活性自由基物质，刺激处在该区域的细胞局部，实现对细胞样品的定点自由基刺激,可以通过自由基检测试剂对刺激区域进行判断(如氨基苯基荧光素APF及羟苯基荧光素HPF)，并根据代谢物判断细胞受损的情况(可以用Liperfluo荧光探针来测量自由基氧化细胞膜上多不饱和脂肪酸所形成的脂质过氧化物)。本专利技术的有益效果是(1)本专利技术采用原位产生活性氧自由基的方式进行细胞刺激，较好地避免了因自由基不稳定而带来的操作不便性。(2)本专利技术中自由基反应只会在微米级别的区域中发生，实现了对细胞局部微区的自由基刺激，进而能够进一步观察细胞对于局部自由基刺激的响应行为。(3)本专利技术可用于研究单细胞的不同部位对于细胞的重要性，即利用自由基轰击细胞不同部位时，观察细胞是否受到致命性影响。(4)本专利技术采用非接触的方式，利用芯片出口所产生的液流处理细胞，避免了固体芯片与细胞样品接触而可能带来的机械损害。(5)本专利技术具有一定的可扩展性，除了活性氧自由基之外亦可用于其他活性物质的原位产生反应，实现该活性物质对于细胞局部微米区域的定点刺激。附图说明图1为原位自由基刺激的微流控装置结构示意图。图2为微流控芯片底部流体分布侧视图。图3为细胞样品附近流体区域的底视图。具体实施方式本专利技术提供一种能对单细胞局部微区进行自由基刺激的装置，下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细的描述。如图1所示，其包括细胞样品操控平台1和芯片对准装置2。细胞样品操控平台1上方设置有芯片对准装置2，芯片对准装置2底端出口可原位产生活性自由基，目标细胞在样品操控平台1上接受局部自由基刺激；其中，细胞样品操控平台1包括电控XY位置控制平台3、温度控制器4、细胞样品6、细胞培养缓冲液7、细胞培养皿8、显微镜物镜9。电控载物台3上设置有温度控制器4，温度控制器4上放置装有细胞培养缓冲液7的细胞培养皿8。待处理的细胞样品6在细胞培养皿8中，浸没于细胞培养缓冲液7液面下。电控载物台3下设置有显微镜物镜9，用以观察细胞样品6和微流控探针。如图1所示，芯片对准装置2包括微流控芯片5、XYZ位置控制平台(图中未示出)。微流控芯片5固定在XYZ位置控制平台上，调整XYZ位置控制平台,使得微流控芯片5移动到所需位置。微流控芯片5与多个流动注射泵(图中未示出，相连接，因此驱动芯片内液体流动。在实施例中，细胞样品6以102～104个/平方厘米的密度种植在细胞培养皿8里。如图2所示，微流体芯片5拥有三条通道，分别与三个流动注射泵相连接(图中在三个箭头处标出至流动注射泵所示)。如图2箭头所示，边缘两个通道分别注入A和B两种反应物溶液，中间的通道从培养皿中抽取液体。A和B两种反应物溶液会在中间通道底部产生微米区域的混合反应区，活性自由基会在该微区中原位产生并刺激与该区域接触的细胞组分，实现单细胞局部自由基刺激。上述各实施例中，如图3所示，通过调整流速及芯片底部距离样品的距离，使得A和B两种反应物溶液交汇形成的反应微区处在几个微米的尺度，从而实现对单细胞局部微米级别区域的自由基刺激，刺激区域可以通过自由基检测试剂或细胞氧化损伤代谢检测试剂进行判断。可以通过自由基检测试剂对刺激位置进行判断(如氨基苯基荧光素APF及羟苯基荧光素HPF)，并根据代谢物判断细胞受损的情况(比如自由基氧化细胞膜上多不饱和脂肪酸所形成的脂质过氧化物，可以用Liperfluo荧光探针来测量)。能够产生活性氧自由基的反应体系多种多样，在一个优选的实施例中，反应物溶液可以是：A为黄嘌呤氧化酶，B为黄嘌呤或次黄嘌呤。在一个优选的实施例中，反应物溶液可以是：A为葡萄糖氧化酶，B为葡萄糖及芬顿试剂，细胞培养缓冲液7为DPBS(Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline)缓冲液。综上所述，本专利技术在使用时，其过程如下：1)在显微镜物镜9的观察下，通过XYZ位置控制平台(图中未示出)将所述微流控芯片调本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置，其特征在于：该装置包括芯片对准装置、细胞样品操控平台及流动注射泵；细胞样品置于所述样品操控平台上，微流控芯片固定在芯片对准装置上，利用对准装置将芯片悬于操控平台上方，对准目标细胞的特定位置；利用流动注射泵驱动芯片内流体，芯片出口处将形成稳定的层流分布，所注入的流体交汇于微米区域中，反应物在微米区域中原位反应产生新鲜的自由基物质，进而对处在该区域的细胞局部结构进行定点轰击。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置，其特征在于：该装置包括芯片对准装置、细胞样品操控平台及流动注射泵；细胞样品置于所述样品操控平台上，微流控芯片固定在芯片对准装置上，利用对准装置将芯片悬于操控平台上方，对准目标细胞的特定位置；利用流动注射泵驱动芯片内流体，芯片出口处将形成稳定的层流分布，所注入的流体交汇于微米区域中，反应物在微米区域中原位反应产生新鲜的自由基物质，进而对处在该区域的细胞局部结构进行定点轰击。


2.根据权利要求1所述用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置，其特征在于：所述芯片对准装置包括XYZ位置控制平台和微流控芯片，所述微流控芯片固定于所述XYZ位置控制平台上，以此操控芯片在三维方向上的运动。


3.根据权利要求1所述用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置，其特征在于：所述微流控芯片有三根平行通道，边缘的两个通道注入不同反应试剂，中间的通道进行培养皿中液体的抽取；其中培养皿中液体包括培养皿中已存在的环境溶液及所注入的反应试剂溶液。


4.根据权利要求1所述用于活体贴壁单细胞局部微区原位自由基刺激的微流控装置，其特征在于：所述细胞样品操控平台包括电控载物台、培养皿、细胞培养缓冲液、细胞样品和显...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金明，张强，林玲，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11