一种体外培育牛黄及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种体外培育牛黄及其制备方法。以新鲜的牛胆汁为原料，利用现代分离技术获得高纯度的结合胆汁酸（牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸，甘氨去氧胆酸）。通过对工业化的体外培育牛黄工艺进行技术提升，在培育环节加入高纯度的结合胆汁酸，最终制得的体外培育牛黄成品不仅符合质量标准，而且结合胆汁酸总含量在4%以上，质量稳定，与优质天然牛黄基本一致。

【技术实现步骤摘要】
一种体外培育牛黄及其制备方法
本专利技术属于体外培育牛黄
，具体涉及利用现代分离技术方法获得结合胆汁酸并用于生产体外培育牛黄的工艺方法及由此方法获得的体外培育牛黄。
技术介绍
牛黄即牛胆结石，胆汁酸是其多种有效成分中的一类，胆汁酸分为结合胆汁酸和游离胆汁酸，其中结合胆汁酸如牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸有抗菌、消炎等药理作用，其含量高低是区别优质或劣质牛黄的重要指标之一。天然牛黄是自然形成的产物，质量难免存在差异，其结合胆汁酸的含量也有较大的差异，优质的天然牛黄总结合胆汁酸含量大多在3～7％，如优质的澳洲牛黄(结合胆汁酸含量见表1)。但优质牛黄来源有限，且价格昂贵。表1：优质澳洲牛黄主要结合胆汁酸含量统计表现有的体外培育牛黄生产工艺是以牛胆汁为原料，经过细菌发酵后，加入一定量的氢氧化钙、胆红素、胆酸等物质，根据天然牛黄形成机制，运用生物化学、物理化学、流体力学等技术手段，在模拟胆囊内进行培育，通过工业化设备生产而成。现有技术生产的体外培育牛黄，其质量指标与优质天然牛黄相近，其安全性和有效性经过了国家有关部门的认可，2004年国家药品监督管理部门下发文件，同意体外培育牛黄可以等同替代天然牛黄(国食药监注[2004]21号)，缓解了天然牛黄资源紧缺的局面，保障了一些传统名方名药的生产，是中医药传承与创新的典范。然而，一方面，由于牛胆汁来源的不同，牛胆汁中的结合胆汁酸含量有较大差异，能够满足体外培育牛黄工艺要求的牛胆汁有限，牛胆汁资源不能得到充分利用。另一方面，要使成品的差异控制在合理范围内，导致工业化生产过程的控制环节较多，控制流程比较繁琐。随着体外培育牛黄应用范围不断扩展，市场需求日益增长，需要一种新方法，能够更充分的利用不同来源牛胆汁中的结合胆汁酸，并应用到体外培育牛黄的工业化生产中，使生产控制过程更为优化，产品的批次间差异更小。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种体外培育牛黄的新方法，从牛胆汁中提取高纯度的结合胆汁酸，并对原有体外培育牛黄的生产工艺进行技术提升，在培育环节加入高纯度的结合胆汁酸和助悬剂，使得最终成品总结合胆汁酸含量在4％以上，含量稳定，与优质天然牛黄基本一致，是优质天然牛黄的理想代用品。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：第一方面，提供一种体外培育牛黄的方法，包含以下步骤：1)结合胆汁酸的制备：所述结合胆汁酸为牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸；以牛胆汁为原料进行以下处理：①黏多糖的去除：每升牛胆汁中加入100ml0.02％的CTAB溶液，搅拌5min，静置30min，过滤去除沉淀，得滤液；②蛋白质的去除：用氢氧化钠将步骤①的滤液pH调至10～10.5，向每升滤液中加入适量的0.02％的硫酸锌或氯化锌溶液，适量的0.01％的氯化钙或硝酸钙溶液形成金属盐类复合物，过滤去除沉淀，得滤液；③结合胆汁酸混合物的获取：用浓盐酸将步骤②中滤液pH调至1～2，搅拌2min，静置20min，离心收集沉淀物；④结合胆汁酸的分离：将步骤③收集的沉淀物与100～200目硅胶以(5～6):(3～4)比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱100～200目硅胶量5kg，高度35cm；单次上样量500～600g，拌样硅胶量300～400g，高度5～6cm，以乙酸乙酯/甲醇/甲酸为洗脱液进行洗脱，洗脱速度5～8ml/s，具体洗脱方式：先后经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸体积比＝(50～90):(0.7～1.3):(0.7～1.3)洗脱45～65L得甘氨去氧胆酸，(70～130):(1.4～2.6):(0.7～1.3)洗脱30～50L得甘氨胆酸，随后(55～105):(14～26):(0.7～1.3)洗脱14～26L得牛磺去氧胆酸，最后经过(52～98):(18～32):(0.7～1.3)洗脱28～52L得牛磺胆酸；2)复合胆红素钙的制备：取250L牛胆汁，加入牛磺酸，蒸汽灭菌，加入2.5L大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或者其组合菌液，进行发酵，控制发酵温度36～39℃，罐内压力0.45～0.5bar，pH值6～8，搅拌机转速50～60r/min，发酵80～90h，得发酵牛胆汁240～253L，加饱和氢氧化钙溶液，搅拌15～30min、煮沸15～20min、冷却，过滤得沉淀物11～14kg，向沉淀物中加入胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌和硫酸镁并置于高速分散机中，加100～200L纯化水搅拌1～2h，冷冻真空干燥并粉碎，得复合胆红素钙粉末25～35kg；3)培育与成形：按照每100kg复合胆红素钙中加50～100L步骤2)中的发酵牛胆汁，100～150L纯化水，添加步骤1)获得的结合胆汁酸，助悬剂羟丙甲基纤维素，搅拌15～30min，均匀分散，静置30～60min，加酸调节pH至5.5～6.8，偏轴定向旋转培育形成类球形物，干燥得成品。优选地，上述步骤1)②中，每升滤液中加入0.02％硫酸锌或氯化锌溶液以及0.1％氯化钙或硝酸钙溶液的体积均为15～25ml。优选地，上述步骤1)④中，将步骤③收集的沉淀物与100-200目硅胶以5:4的比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱硅胶量5kg，装柱100-200目硅胶高度35cm。优选地，上述步骤1)④中，单次上样量500g，拌样硅胶量400g，拌样硅胶高度5cm，具体洗脱方式：先后经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸体积比＝70/1/1洗脱50L得甘氨去氧胆酸，100/2/1洗脱40L得甘氨胆酸，随后80/20/1洗脱20L得牛磺去氧胆酸，最后经过75/25/1洗脱40L得牛磺胆酸。优选地，上述步骤2)中，向250L牛胆汁中加入7.5～15kg牛磺酸，向240-253L发酵牛胆汁中加入240～1000L饱和氢氧化钙溶液，向过滤得的11-14kg沉淀物中加入10～15kg胆红素，1.5～3kg胆酸，0.8～1.5kg去氧胆酸，0.12～0.2kg硫酸锌，0.12～0.2kg硫酸镁。优选地，上述步骤3)中，向每100kg复合胆红素钙中加入上述步骤1)获得的结合胆汁酸的质量如下：牛磺胆酸2～3kg，甘氨胆酸2～3kg，牛磺去氧胆酸0.7～0.9kg，甘氨去氧胆酸0.7～0.9kg，所加入的羟丙甲基纤维素0.2～0.3kg。第二方面，提供利用上述方法制备的体外培育牛黄。牛胆汁除水分外，含有胆汁酸、胆色素、黏多糖类、蛋白质类以及无机盐等物质。本专利技术利用CTAB能与黏多糖类物质形成沉淀而去除黏多糖类物质，利用Zn2+和Ca2+等金属离子在碱性条件下能与大多数蛋白质反应形成沉淀而去除大部分蛋白质类物质。大部分结合胆汁酸主要以钠盐的形式存在牛胆汁中，在pH为酸性的情况下，转化为结合胆汁酸，因不溶于水而沉淀，收集得到粗胆汁酸类物质。通过层析分离的方法，得到不同种类的结合胆汁酸。按以上步骤1L牛胆汁可提取牛磺胆酸14.2～16.3g，甘氨胆酸10.2～13.3g，牛磺去氧胆酸3.5～4.9g，甘氨去氧胆酸2.8～3.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外培育牛黄的方法，其特征在于，包含以下步骤：/n1）结合胆汁酸的制备：所述结合胆汁酸为牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸；以牛胆汁为原料进行以下处理：/n

【技术特征摘要】
1.一种体外培育牛黄的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）结合胆汁酸的制备：所述结合胆汁酸为牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸；以牛胆汁为原料进行以下处理：

黏多糖的去除：每升牛胆汁中加入100ml0.02%的CTAB溶液，搅拌5min，静置30min，过滤去除沉淀，得滤液；
②蛋白质的去除：用氢氧化钠将步骤的滤液pH调至10～10.5，向每升滤液中加入适量的0.02%的硫酸锌或氯化锌溶液，适量的0.01%的氯化钙或硝酸钙溶液形成金属盐类复合物，过滤去除沉淀，得滤液；

结合胆汁酸混合物的获取：用浓盐酸将步骤②中滤液pH调至1～2，搅拌2min，静置20min，离心收集沉淀物；

结合胆汁酸的分离：将步骤收集的沉淀物与100～200目硅胶以（5～6）:（3～4）比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱100～200目硅胶量5kg，高度35cm；单次上样量500～600g，拌样硅胶量300～400g，高度5～6cm，以乙酸乙酯/甲醇/甲酸为洗脱液进行洗脱，洗脱速度5～8ml/s，具体洗脱方式：先后经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸体积比=（50～90）:（0.7～1.3）:（0.7～1.3）洗脱45～65L得甘氨去氧胆酸，（70～130）:（1.4～2.6）:（0.7～1.3）洗脱30～50L得甘氨胆酸，随后（55～105）:（14～26）:（0.7～1.3）洗脱14～26L得牛磺去氧胆酸，最后经过（52～98）:（18～32）:（0.7～1.3）洗脱28～52L得牛磺胆酸；
2）复合胆红素钙的制备：取250L牛胆汁，加入牛磺酸，蒸汽灭菌，加入2.5L大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或者其组合菌液，进行发酵，控制发酵温度36～39℃，罐内压力0.45～0.5bar，pH值6～8，搅拌机转速50～60r/min，发酵80～90h，得发酵牛胆汁240～253L，加饱和氢氧化钙溶液，搅拌15～30min、煮沸15～20min、冷却，过滤得沉淀物11～14kg，向沉淀物中加入胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌和硫酸镁并置于高速分散机中，加100～200L纯化水搅拌1～2h，冷冻真空干燥...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗张龙，蔡红娇，徐冬平，石则勇，
申请(专利权)人：武汉健民大鹏药业有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42