本发明专利技术涉及生物医药领域，涉及一种熊胆粉的制作工艺，具体涉及一种人工熊胆粉的制作工艺。本方案通过使用含细胞活性物质的转化液，解决了酶的纯化步骤复杂且成本高和酶活不易保持的技术问题。采用本方案进行禽畜胆粉的生物转化后，获得的人工熊胆粉的牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸比例与天然熊胆粉近似，本方案的人工熊胆粉可以作为天然熊胆粉的替代品进行精深加工和进一步应用。采用本方案生产的人工熊胆粉产品批次差异小，采用本工艺可将生产过程标准化，并且提升转化效率，可工业化放大生产。
【技术实现步骤摘要】
一种人工熊胆粉的制作工艺
本专利技术涉及生物医药领域，涉及一种熊胆粉的制作工艺，具体涉及一种人工熊胆粉的制作工艺。
技术介绍
熊胆粉，由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到，是名贵中药材，有2000余年的入药历史，大量处方中都含有熊胆成分。熊胆粉具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用，是保肝护胆的良药。各种现代临床实践应用也表明，熊胆能够治疗多种肝胆疾病。由于野生熊资源有限，现在普遍使用人工养殖“引流取胆”的方法生产熊胆粉(即天然熊胆粉)。目前，我国每年的天然熊胆粉产量约30吨，无法满足人们日益增长的健康需求。为了解决天然熊胆粉短缺的问题，大量人工熊胆粉应运而生，例如：以其他动物胆为原料，将其中的牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)通过化学或生物方法转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，获得人工熊胆粉。中国专利技术专利CN201410588581.5，以禽畜胆汁直接冷冻干燥制得的禽畜胆粉为原料，用固定化的7α-羟基类固醇脱氢酶和固定化的7β-羟基类固醇脱氢酶进行生物转化后，制得人工熊胆粉。此种方法，底物(禽畜胆粉)成分复杂，对两种酶的酶活造成了较大影响，需要将生物转化所用到的酶固定到壳聚糖载体上制成固定化酶柱，步骤繁琐，成本高昂，反应体系不易放大。并且在对酶进行固定化处理之前，纯化富集上述两种酶的过程也较为复杂和耗时。现有技术的人工熊胆的生物转化存在酶的纯化步骤复杂且成本高和酶活不易保持的问题，使得工艺不易放大，严重影响了人工熊胆粉的制备效率，无法满足市场对人工熊胆粉的需求。
技术实现思路
本专利技术意在提供一种人工熊胆粉的制作工艺，通过使用含有两种酶的菌悬液或者上清液作为转化液，解决了酶的纯化步骤复杂且成本高和酶活不易保持的技术问题。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种人工熊胆粉的制作工艺，包括用于将牛磺鹅去氧胆酸转换为牛磺熊去氧胆酸的生物转化步骤：包括含有禽畜胆粉、转化缓冲液和转化液的转化体系；所述转化液为包含酶菌体的菌悬液或者包含酶菌体的原生质体的上清液；所述酶菌体表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。本方案的原理及优点是：本方案直接使用酶菌体或酶菌体裂解后的上清液进行禽畜胆粉的生物转化，经生物转化后获得的反应液经后续处理之后，可获得人工熊胆粉。本方案的生物转化过程使得禽畜胆粉中的一定量的牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)。牛磺鹅去氧胆酸向牛磺熊去氧胆酸转化的过程具体是：在7α-羟基类固醇脱氢酶的催化作用下，牛磺鹅去氧胆酸转换为中间体牛磺7-酮石胆酸(T-7-KLCA)；牛磺7-酮石胆酸再在7β-羟基类固醇脱氢酶的催化下转换成牛磺熊去氧胆酸。经转化后的禽畜胆粉(即人工熊胆粉)的功效成分组成和天然熊胆粉的功效成分保持一致(在天然熊胆粉中，TUDCA/TCDCA＝1.1-1.5：1)。在本方案中，禽畜胆粉是指从禽类或者畜类动物的胆中提取胆汁等物质，再制备获得禽畜胆粉。本方案的工程菌的构建的大致过程为：将7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶的基因构建在表达载体上，再将表达载体转入菌(例如大肠杆菌)中，从而制备获得工程菌。酶菌体是诱导工程菌大量繁殖并表达7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶而形成。7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的活性受外界环境(特别是酶促反应进行的环境)影响较大。特别是在本方案的含有大量禽畜胆粉的转化体系中，由于禽畜胆粉含有较多杂质(特别是一些对7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶具有毒性或抑制作用的物质)，对这两种酶的活性带来了较大的抑制作用，较为严重地影响了禽畜胆粉的生物转化过程。现有技术中，为了减少禽畜胆粉对酶活的影响，研究人员采用了用壳聚糖固定酶的方法。但是，现有的方案步骤繁琐，成本高昂，反应体系不易放大。专利技术人尝试了多种方法来避免禽畜胆粉中的杂质对7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的酶活的影响，发现酶菌体的原生质体(其中含有大量生物活性物质)对抵抗转化体系中的毒性环境有较好的作用。传统观念认为，将酶提取纯化和富集之后，足量的酶可以和底物充分结合。但是在含有禽畜胆粉的转化体系中，杂质(禽畜胆粉中非牛磺鹅去氧胆酸的部分被认为是杂质)对这两种酶形成一定的抑制，阻碍了两种酶与目的化合物(牛磺鹅去氧胆酸以及反应中间体牛磺7-酮石胆酸)的结合，影响了催化效率。当使用菌悬液或者上清液作为两种酶的载体的时候，酶菌体或者原生质体对酶形成保护，阻碍了杂质对酶活性的影响，但是，酶菌体或者原生质体并未阻碍酶和牛磺鹅去氧胆酸等目的成分的结合，仍然可以对底物进行有效催化。本方案使用两种酶同时催化禽畜胆粉的生物转化，不同于现有技术中的分步转化的过程，容易产生较多的中间体牛磺7-酮石胆酸。专利技术人在生产实践的过程中发现，在大量底物(禽畜胆粉)存在的情况下，7β-羟基类固醇脱氢酶的活性受到较大的影响，导致反应中间体牛磺7-酮石胆酸不能被7β-羟基类固醇脱氢酶转化为牛磺熊去氧胆酸，中间体增多，影响最终产物的品质。但是由于本方案使用转化液，工程菌的原生质体内的活性物质对7β-羟基类固醇脱氢酶具有较强保护作用(比对7α-羟基类固醇脱氢酶的保护作用更强)，该酶催化反应中间体牛磺7-酮石胆酸形成牛磺熊去氧胆酸的效率更高。采用本方案的制备方法，中间体牛磺7-酮石胆酸在最终产物中的含量非常低，提升了产品质量。综上所示，本方案的有益效果在于：(1)由于转化液的使用，酶的活性得到保证，催化禽畜胆粉生物转化的效率提升，提高了人工熊胆粉中的牛磺熊去氧胆酸的含量。(2)在禽畜胆粉溶液中，加入菌悬液或者上清液进行转化，不用再进行酶的纯化步骤，避免纯化过程中引入外源性杂质，节约了时间和经济成本。(3)相对于壳聚糖固定化酶的现有技术中的方案，本方案的转化过程能够按比例进行放大，放大后转化效果可控，易于工业化放大生产。(4)本方案的转化体系中不含有培养基等成分，体系黏度低，可以在体系中加入较为大量的底物(禽畜胆粉)，实现一次性对大量底物的生物转化。(5)生物转化后，牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸比例与天然熊胆粉近似，本工艺的产品可以作为天然熊胆粉的替代品进行精深加工。进一步，所述菌悬液的制备方法为：将酶菌体分散于转化缓冲液中，获得菌悬液；所述上清液的制备方法为：对所述菌悬液中的酶菌体进行破碎处理后，离心获得上清液。采用上述方案，菌悬液和上清液的制备方法简单，适合于扩大生产。进一步，所述酶菌体为表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌B组成的混合物；或者所述酶菌体为同时表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶的工程菌C。采用上述方案，工程菌C共表达两种酶，或者工程菌A和B分别表达7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，两种方式均可实现对底物的催化转化。进一步，每10g酶菌体使用20-100ml转化缓冲液分散，获得菌悬液；表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，包括用于将牛磺鹅去氧胆酸转换为牛磺熊去氧胆酸的生物转化步骤：包括含有禽畜胆粉、转化缓冲液和转化液的转化体系；所述转化液为包含酶菌体的菌悬液或者包含酶菌体的原生质体的上清液；所述酶菌体表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。/n
【技术特征摘要】
1.一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，包括用于将牛磺鹅去氧胆酸转换为牛磺熊去氧胆酸的生物转化步骤：包括含有禽畜胆粉、转化缓冲液和转化液的转化体系；所述转化液为包含酶菌体的菌悬液或者包含酶菌体的原生质体的上清液；所述酶菌体表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。
2.根据权利要求1所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，所述菌悬液的制备方法为：将酶菌体分散于转化缓冲液中，获得菌悬液；所述上清液的制备方法为：对所述菌悬液中的酶菌体进行破碎处理后，离心获得上清液。
3.根据权利要求2所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，所述酶菌体为表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌B组成的混合物；或者所述酶菌体为同时表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶的工程菌C。
4.根据权利要求3所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，每10g酶菌体使用20-100ml转化缓冲液分散，获得菌悬液；表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌B的质量比为1:10-1:2。
5.根据权利要求4所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于：所述转化缓冲液为0-15mM的甘氨酸缓冲液；所述转化液的体积为转化体系的体积的1/5-4/5。
6.根据权利要求5...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵志斌，王丹丹，秦松柏，程雷，丁峰，罗德彬，张苏敏，
申请(专利权)人：重庆极泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。