一种六胜肽的规模化合成方法技术

本发明专利技术公开了一种六胜肽的规模化合成方法，该方法是以2‑Chlorotrityl Chloride Resin为载体，固相合成Ac‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑OH全保护肽酸，然后以全保护肽酸为原料，通过液相酰胺化反应合成Ac‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Met‑Gln(Trt)‑Arg(Pbf)‑Arg(Pbf)‑NH

【技术实现步骤摘要】
一种六胜肽的规模化合成方法
本专利技术属于多肽合成
，具体涉及一种固-液结合的六胜肽合成方法。
技术介绍
六胜肽，又叫阿基瑞林、乙酰基六肽-8，最初是从南极湾冰河泥中所发现的菌种，是一种具有除皱功能的活性多肽，序列为Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，是由突触蛋白SNAP-25的氮端(AA12～17)衍生而来的六个氨基酸肽链，能与SNARE三元复合物相互作用，抑制嗜铬细胞中受Ca2+调控的儿茶酚胺释放，从而阻止神经-肌肉间的乙酰胆碱传导，引起肌肉麻痹。六胜肽是肉毒毒素类的安全替代品，由于能够阻断神经肌肉间的信息传导，避免肌肉过度收缩，皮下新合成的胶原蛋白得以重排，皱纹缓解甚至消除。10％乳液涂抹眼角30天，可使眼角鱼尾纹深度减少30％。因此，多用于化妆品内作为抗皱成分。目前，六胜肽的合成方法主要有固相合成法和液相分段合成法。目前已公开的几种合成方法，均存在不同的局限性。固相合成法的特点是将肽链连接在固相载体，通过过量反应物提高反应收率，同时反复洗涤就能除去杂质，节省了反应时间。然而，固相载体多选用氨基型Linker树脂，如RinkAmideAMResin或者RinkAmideMBHAResin，这一类树脂的特点是上载量较小，价格普遍昂贵，达到规模化合成原料成本就足以昂贵，一般只能进行小批量合成，限制了六胜肽的产业化。例如，CN103694316A采用RinkAmideMBHAResin作为树脂载体固相合成，取代度仅为0.5mmol/g，且价格昂贵，必然造成成本昂贵，不适用于大规模生产。液相分段合成法的特点是原料成本降低，但液相反应时间普遍较长，中间过程需柱层析或重结晶等纯化分离步骤，人工成本骤升。如CN103613642A采用液相分段合成，原料成本降低，但合成周期长，效率低，纯化成本高，不适用于规模化合成。CN106632609A采用固-液结合的合成策略，优先液相合成Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH片段，再与RinkAmideAMResin连接。精氨酸二肽片段在多肽合成领域作为困难序列，不管作为氨基组分和羧基组分，液相合成都较为困难且难以保证纯度，本质上固相载体未发生改变，不适用于大规模合成。CN196749529A采用固-液结合的合成策略，改变了合成载体，选用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羟基苯丙三唑合成活化酯，选用氯化铵作为氨试剂，但氯化铵作为无机盐，在有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺溶解度很小，故此酰胺化反应转化率不超过70％，原料剩余同时存在消旋风险，合成收率低且纯度无法保证，不利于规模合成。CN110684077A公开了一种可规模化合成六胜肽的方法，该合成方法选用2-ChlorotritylChlorideResin为载体，固相合成全保护肽酸，所述全保护肽酸进行液相酰胺化反应，得到全保护酰胺粗品，全保护酰胺粗品经柱层析分离未转化完全的原料后，脱保护得到六胜肽粗品。该方法树脂价格相对氨基树脂便宜，而上载量增加近一倍，同样投料量下，树脂肽产率增加，目标肽总收率增加；采取低温控制，有效抑制了液相酰胺化反应消旋；选用的氨试剂为氨水，廉价易得；切割工艺弃用苯酚与乙二硫醇；弃用经典的析出沉淀剂-易制毒溶剂无水乙醚，改用乙酸乙酯，安全性高、对环境友好，利于工业化生产。但此方法的不足在于：全保护肽酸酰胺化反应时，C端精氨酸作为羧基组分，难以活化完全，同时生成的活化酯在氨水作用下少量发生水解。酰胺化反应完成后，有未转化完全的原料残余，而全保护肽酸和全保护酰胺分子量相差1，极性相近，在反向HPLC上为同一位置出峰，难以重结晶除去；虽然通过薄层层析色谱可经过正向柱层析分离除去，但因两者极性相近，Rf值相差不大，柱层析对洗脱剂比例要求严格，分离难度系数高，分离周期较长，考验工作者的TLC分析能力与柱层析分离能力。且全保护酰胺作为长肽片段，酯溶性不高、柱层析体系选用DCM/MeOH体系，DCM易挥发，容易影响洗脱剂比例而造成分离效果不佳，影响制备纯化。在工业化上柱层析需消耗大量的溶剂，洗脱液在浓缩过程中的溶剂回收率低于50％，增加了原料成本、工艺合成周期与人工成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种方法简单、生产成本低，易纯化、生产效率高的规模化合成六胜肽的方法。针对上述目的，本专利技术采用的技术方案是：以2-ChlorotritylChlorideResin为载体，固相合成全保护树脂肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-2-ChlorotritylChlorideResin，所述全保护树脂肽经切割液裂解后获得全保护肽酸Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH，所述全保护肽酸与氨水进行液相酰胺化反应，得到全保护酰胺Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2粗品(具体方法与公开号为CN110684077A、专利技术名称为“一种阿基瑞林的规模化合成方法”中公开的柱层析之前的步骤相同)，所述粗品经二次液相酰胺化反应，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Dmb混合物，所得混合物经脱除保护基、反相制备色谱纯化、冷冻干燥，得到六胜肽纯品。上述二次液相酰胺化反应的方法为：将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在0～5℃下加入1-羟基苯并三唑、N,N′-二异丙基碳二亚胺，并在该温度下反应40～90分钟，然后加入2,4-二甲氧基苄胺，继续在该温度下反应5～7小时，再将反应液加入1.5～3倍体积的质量浓度为20％～40％的柠檬酸水溶液中，析出沉淀，过滤，沉淀用饱和食盐水洗涤后40～45℃烘干，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Dmb混合物。上述二次液相酰胺化反应的方法进一步优选：将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在0～5℃下加入1-羟基苯并三唑、N,N′-二异丙基碳二亚胺，并在该温度下反应60分钟，然后加入2,4-二甲氧基苄胺，继续在该温度下反应6小时，再将反应液加入2倍体积的质量浓度为30％的柠檬酸水溶液中，析出沉淀，过滤，沉淀用饱和食盐水洗涤后40～45℃烘干，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Ar本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种六胜肽的规模化合成方法，其特征在于：以2-Chlorotrityl Chloride Resin为载体，固相合成全保护树脂肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin，所述全保护树脂肽经切割液裂解后获得全保护肽酸Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH，所述全保护肽酸与氨水进行液相酰胺化反应，得到全保护酰胺Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH

【技术特征摘要】
1.一种六胜肽的规模化合成方法，其特征在于：以2-ChlorotritylChlorideResin为载体，固相合成全保护树脂肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-2-ChlorotritylChlorideResin，所述全保护树脂肽经切割液裂解后获得全保护肽酸Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH，所述全保护肽酸与氨水进行液相酰胺化反应，得到全保护酰胺Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2粗品，所述粗品经二次液相酰胺化反应，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Dmb混合物，所得混合物经脱除保护基、反相制备色谱纯化、冷冻干燥，得到六胜肽纯品；
上述二次液相酰胺化反应的方法为：将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中，在0～5℃下加入1-羟基苯并三唑、N,N′-二异丙基碳二亚胺，并在该温度下反应40～90分钟，然后加入2,4-二甲氧基苄胺，继续在该温度下反应5～7小时，再将反应液加入1.5～3倍体积的质量浓度为20％～40％的柠檬酸水溶液中，析出沉淀，过滤，沉淀用饱和食盐水洗涤后40～45℃烘干，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Dmb混合物。


2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晨，王惠嘉，王昕，王万科，杨小琳，赵金礼，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61