本发明专利技术公开了一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法。本发明专利技术建立了一种能够同时测定灰尘中两种主要尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物Nitrated Der f1和Nitrated Der p1的检测方法。灰尘样品中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物经酶解消化成小分子的多肽，选择其中的一条丰度最高的多肽作为尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽，超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)对这些特征多肽进行定性定量，通过换算从而对尘螨过敏原蛋白及其硝化产物进行定性和定量分析。本方法选择性好，准确度和分析通量高，本方法克服了传统ELISA(酶联免疫吸附法)方法检测通量低，可能存在结构类似物的交叉反应和无法准确定量硝化蛋白的缺点。
【技术实现步骤摘要】
一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Derf1和Derp1及其硝化产物的检测方法
本专利技术属于环境健康的过敏原蛋白检测领域，是一种利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC/ESI-MS/MS)，选择尘螨主要过敏原蛋白Derf1和Derp1及其硝化产物NitratedDerf1和NitratedDerp1为研究对象，建立的能够同时测定灰尘中两种尘螨主要过敏原蛋白含量及其硝化产物(共四种过敏原蛋白)的定量检测方法。
技术介绍
随着工业化程度的提高，哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等过敏性疾病在全世界范围内呈逐年增高的趋势，世界卫生组织(WHO)已经把过敏性疾病列为“21世纪重点研究和预防的疾病”。目前全球已有大量研究证实了尘螨与过敏性哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等过敏性疾病密切相关。尘螨在全世界各个国家都有分布，全世界范围内最为常见的尘螨种类是屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)。尘螨中的某些蛋白质被认为是导致过敏的主要成分。免疫学研究证明，I类过敏原蛋白是引发尘螨过敏性疾病的主要因素，超过80％的尘螨过敏患者对I类过敏原蛋白(粉尘螨I类过敏原蛋白Derf1和屋尘螨I类过敏原蛋白Derp1)的皮肤针刺试验和血清IgE检测呈阳性。有研究表明，O3浓度水平的升高和NOX的存在会引起过敏原蛋白的硝化，从而提高过敏原蛋白的致敏性，使得人体罹患过敏性疾病的风险增加。蛋白质的硝化主要是指蛋白质中酪氨酸残基被硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)的过程。空气污染是当前我国面临的主要环境问题之一。尽管经过近几年的强力治理，PM10、PM2.5、SO2等典型大气污染物已经得到初步的控制，但O3的浓度却在逐年升高，这使得过敏原蛋白被硝化的可能性大大增强，给人们的健康增添极大的隐患。因此，环境中过敏原蛋白和硝化过敏原蛋白的存在及含量状况亟需得到大家的重视。1988年世界卫生组织(WHO)召开的尘螨与哮喘国际研讨会上制定了暂行的评价标准：Derp1含量超过2μg·g-1足以引起过敏症状，是致敏和哮喘发生的危险因素，Derp1含量超过10μg·g-1则足以诱发对尘螨过敏的哮喘病人急性发作或更重的临床病症。未硝化的过敏原蛋白在环境中超过一定含量就可以对人体健康构成威胁，使得罹患尘螨过敏性疾病的机率大大增加，而已有的研究表明，硝化后的过敏原蛋白其致敏性会增强，使得人体健康的风险更大，因此，对人居环境中尘螨过敏原蛋白及其硝化产物准确定性定量显得尤为重要。通过研究环境灰尘样本中尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的含量水平，揭示环境中尘螨过敏性疾病的健康风险，从而对有效地预防和避免尘螨过敏提出有效建议。目前最常使用的检测过敏原的分析方法是基于抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，ELISA方法灵敏度高，检测时间短，但目前市面上大部分试剂盒都是针对单一过敏原设计的，无法对多种过敏原同时进行检测，检测通量较低，并可能存在结构类似物的交叉反应，此方法难以适用于当今环境中多种过敏原的高通量及痕量检测。ELISA也可以用于硝化蛋白质的测定，但ELISA方法以硝化牛血清蛋白为对象制作标准曲线，而所检测的样品中硝化蛋白与抗体的结合能力可能与硝化牛血清蛋白不同，因此ELISA方法只是半定量检测硝化蛋白的方法，而且抗体也并非目标硝化蛋白质的特应性抗体。相比于ELISA方法，高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)利用测序级胰蛋白酶将目标蛋白酶切成相对分子质量较小的多肽混合物，利用一级质谱(MS)或串联质谱(MS/MS)技术检测多肽混合物中各多肽的相对分子质量或碎片离子信息，找到响应好且能够特异性代替目标蛋白的目标多肽。在质谱多反应监测模式(MRM)下，只对目标多肽进行定量分析，从而反算目标蛋白质的含量。高效液相色谱-质谱联用技术不仅能直接对目标过敏原进行鉴定，还可以同时分析不同亚型和修饰状况，方法的选择性、准确度和通量均有很大提高，目前已被广泛应用于食物过敏原蛋白质的研究中。但目前对于利用HPLC-MS/MS检测灰尘样品中的尘螨过敏原蛋白质及其硝化产物的研究还鲜见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，利用超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC/ESI-MS/MS)，选择尘螨主要过敏原蛋白Derf1和Derp1及其硝化产物NitratedDerf1和NitratedDerp1为研究对象，从而对灰尘中两种尘螨主要过敏原蛋白含量及其硝化产物的进行同时检测。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的，一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Derf1和Derp1及其硝化产物NitratedDerf1和NitratedDerp1的检测方法，该方法为：利用特征多肽AR-8、SR-12，特征多肽的硝化物NO2-AR-8，NO2-SR-12以及特征多肽的同位素标记物的最佳质谱参数对样品中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽进行UPLC/ESI-MS/MS，，进而实现灰尘中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的定性与定量。其中，特征多肽AR-8的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，特征多肽SR-12的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步地，具体包括以下步骤：(1)样品采集与前处理采集人们主要活动场所地面上的灰尘样本，用硬纸板和毛刷小心收拢后用锡箔纸包好装入自封袋带回实验室，用普通筛子先粗略筛去肉眼可见的较大颗粒后，用镊子小心夹取纸屑和毛发等物后弃掉，处理后的灰尘样本在-20℃保存。取0.7g左右灰尘样品，按照1:100(w/v)的比例加入含1％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(1％BSA-PBST)。室温下超声粉碎(200V)2h，然后在4℃，100r·min-1振荡过夜，取上清液在4℃，3000×g条件下离心15min，离心后取上清液过0.22μm水系滤膜，-20℃下保存备用。使用BCA蛋白定量试剂盒测定灰尘样品提取液中的总蛋白含量，根据实际测得的灰尘样品中所含的总蛋白质含量，取含400μg总蛋白的灰尘样品提取液于1.5mL低蛋白吸附管中，加入100μL20ng·mL-1的同位素内标，加入200μL乙腈、200μL50mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液，37℃下放置15min；加入200μL还原溶液(含45mmol·L-1DTT、20mmol·L-1TCEP和50mmol·L-1NH4HCO3缓冲液)，37℃下放置30min；加入200μL100mmol·L-1IAA溶液，暗处37℃下混匀放置30min；加入220μL90mmol·L-1DTT储备液猝灭残留的IAA；加入100μL胰酶(40ng·μL-1，HCl稀释)使得酶/底物为1:100(w/w)。在37℃下孵育24h后加入13μL10％甲酸/水(v/v)，涡旋混匀后室温下放置10min；用真空离心浓缩仪使溶剂蒸发，并用200μL5％乙腈/水(v/v)溶液重新溶解。随后4℃下14000r·min-1离心30min，上清液过0.22μm水系滤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Der f1和Der p1及其硝化产物的检测方法，其特征在于，该方法为：利用特征多肽AR-8、SR-12，特征多肽的硝化物NO
【技术特征摘要】
1.一种灰尘中尘螨过敏原蛋白Derf1和Derp1及其硝化产物的检测方法，其特征在于，该方法为：利用特征多肽AR-8、SR-12，特征多肽的硝化物NO2-AR-8，NO2-SR-12以及特征多肽的同位素标记物的最佳质谱参数对灰尘中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的特征多肽进行UPLC/ESI-MS/MS分析，进而实现灰尘中的尘螨过敏原蛋白及其硝化产物的定性与定量。其中，特征多肽AR-8的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，特征多肽SR-12的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)样品采集与前处理
采集人们主要活动场所地面上的灰尘样本，筛去肉眼可见的较大颗粒及纸屑和毛发等物，处理后的灰尘样本在-20℃保存。取0.7g左右灰尘样品，按照1:100(w/v)的比例加入含1％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(1％BSA-PBST)。室温下超声粉碎2h，然后在4℃，100r·min-1振荡过夜，取上清液在4℃，3000×g条件下离心15min，离心后取上清液过0.22μm水系滤膜，-20℃下保存备用。
使用BCA蛋白定量试剂盒测定灰尘样品提取液中的总蛋白含量，根据实际测得的灰尘样品中所含的总蛋白质含量，取含400μg总蛋白的灰尘样品提取液于1.5mL低蛋白吸附管中，加入100μL20ng·mL-1的同位素内标，加入200μL乙腈、200μL50mmol·L-1NH4HCO3缓冲溶液，37℃下放置15min；加入200μL还原溶液(含45mmol·L-1DTT、20mmol·L-1TCEP和50mmol·L-1NH4HCO3缓冲液)，37℃下放置30min；加入200μL100mmol·L-1IAA溶液，暗处37℃下混匀放置30min；加入220μL90mmol·L-1DTT储备液猝灭残留的IAA；加入100μLHCl稀释的40ng·μL-1胰酶，使得酶/底物为1:100(w/w)。在37℃下孵育24h后加入13μL10％甲酸/水(v/...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨方星，徐帆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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