一种灵敏的液相色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种灵敏的色谱‑串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法，属于药物分析技术领域。本发明专利技术建立了液相色谱‑串联质谱法测定人血浆中乙胺丁醇的方法，血浆样品以沉淀蛋白法处理后，采用Atlantis®dC18色谱柱快速梯度洗脱色谱分离，经串联四极杆质谱仪检测。质谱监测离子反应为m/z 205.2®116.2（乙胺丁醇）和

【技术实现步骤摘要】
一种灵敏的液相色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法
本专利技术涉及药物分析
，具体涉及一种灵敏的液相色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法。
技术介绍
盐酸乙胺丁醇是一种一线抗结核病药物。盐酸乙胺丁醇仿制药研发过程中需要进行临床生物等效性研究，对比仿制药物和原研药物在人体内暴露量及吸收程度。因此需要测定血液中乙胺丁醇的浓度。目前血浆中乙胺丁醇的浓度测定方法主要为液相色谱-串联质谱法。但现有检测方法灵敏度较差，定量下限最低仅能达到10ng/mL。目前国内大部分乙胺丁醇规格为0.25g。受限于检测方法灵敏度，临床研究中常常通过增加药物剂量达到0.5g或1g的方法，提升药物在血液中的浓度，进而获得完整的药物动力学参数。药物剂量的提升容易对受试者的身体造成不良影响。另外现有方法也存在操作复杂、需要耗时的浓缩步骤、分析时间长、信噪比不佳等特点。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种灵敏的液相色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法。采用本专利技术的方法可以实现对血浆中乙胺丁醇灵敏、快速检测；而且血浆用量少，样品前处理简单。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种灵敏的色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法，包括如下步骤：（1）对血浆样品进行前处理；（2）采用液相色谱-串联质谱法测定步骤（1）中经前处理后的血浆样品中乙胺丁醇的浓度；所述液相色谱-串联质谱法包括色谱条件和质谱条件，其中：所述色谱条件包括：采用Atlantis®dC18柱，梯度洗脱，在0min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在0.7min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在1min时，流动相A：流动相B体积比为15:85，在1.5min时，流动相A：流动相B体积比为15:85，在1.6min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在2.5min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，流速0.7mL/min，柱温40℃，进样量2μL。流动相A为含0.1%甲酸和5mM醋酸铵水溶液，所述流动相B为甲醇：乙腈：甲酸（50:50：0.1，v/v/v）。所述质谱条件包括：离子源：电喷雾电离正离子检测；喷雾气温度：500℃；雾化气：65psi；气帘气：35psi；碰撞气：9psi；电离电流：3.0uA；扫描时间：200ms；扫描方式：多反应监测。用于定量的离子反应分别为：m/z205.2®116.2（乙胺丁醇）和m/z209.2.2®120.2（乙胺丁醇-d4）；碰撞能量20eV。优选的，步骤（1）中，对血浆样品进行前处理的方法为：向50µL血浆样品中加入50µL内标溶液，再加入400µL体积比为90:10的乙腈-水混合液，涡流振荡10min，4℃条件下以3900rpm速度离心10min，将离心后的上清液转移至另一96孔板中。更优选的，所述内标溶液为100ng/mL的乙胺丁醇-d4溶液，溶剂为体积比50:50的甲醇：水混合液。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术建立了灵敏、快速的液相色谱-串联质谱法测定人血浆中乙胺丁醇的方法。血浆样品以沉淀蛋白法进行处理后直接进样分析，分析方法的定量下限为4.00ng/mL，较现有最灵敏的检测方法灵敏度提升2.5倍。（2）本专利技术与现有技术相比灵敏度得到较大提升，乙胺丁醇临床生物等效性研究中药物的剂量由原来的0.5或1g降低至0.25g，显著提高了临床研究的安全性。（3）本专利技术色谱分析时间更短，分析速度较现有技术提升20%。附图说明图1：乙胺丁醇的[M+H]+的产物离子扫描图。图2：乙胺丁醇-d4的[M+H]+的产物离子扫描图。图3：空白血浆样品中乙胺丁醇（上）和乙胺丁醇-d4（下）的典型色谱图。图4：定量下限样品中乙胺丁醇（上）和乙胺丁醇-d4（下）的典型色谱图。图5：受试者空腹口服250mg盐酸乙胺丁醇片后的血浆浓度-时间曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本专利技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本专利技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本专利技术的范围，而是仅仅表示本专利技术的选定实施例。基于本专利技术的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：盐酸乙胺丁醇（批号：100165-201705，纯度：99.7%）购于中国食品药品检定研究所；盐酸乙胺丁醇-d4（批号：1-WEN-51-4，化学纯度98.0%，同位素纯度99.1%）购于加拿大TRC公司；色谱级甲醇和乙腈均购于美国Sigma公司；色谱级甲酸购于日本TCI公司；色谱级醋酸铵购于美国ROE公司；去离子水由法国Millipore纯水仪制备。美国Waters公司的Atlantis®dC18色谱柱（3.0μm，4.6*100mm）。实施例1：液相色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇1.仪器美国Sciex公司的TripleQuadTM6500+三重四极杆串联质谱仪和Analyst1.6.3数据处理软件；日本岛津公司的LC-30高效液相色谱系统，包括DGU-20A5R脱气机，LC-30AD输液泵，SIL-30AC自动进样器，CTO-20A柱温箱。2.血浆样品前处理：向50µL血浆样品中加入50µL的乙胺丁醇-d4内标溶液（浓度为100ng/mL，溶剂为体积比50:50的甲醇：水混合液），再加入400µL体积比为90:10的乙腈-水混合液，涡流振荡10min，4℃条件下以3900rpm速度离心10min，将离心后的上清液转移至另一96孔板中。取上清液2.0µL进行LC-MS/MS分析。3.标准系列样品和质控样品的制备：称取两份盐酸乙胺丁醇标准品，用甲醇定容溶解获得浓度分别为0.780mg/mL和0.747mg/mL的乙胺丁醇的储备液，一份用于标准系列溶液的配制，一份用于质控（QC）溶液的配制。取乙胺丁醇的储备液和QC储备液以甲醇-水（1:1，v/v）稀释，获得乙胺丁醇标准系列工作溶液和质控溶液，以人的空白血浆稀释标准系列工作溶液和质控溶液，获得血浆浓度分别为4.00、8.00、20.0、50.0、150、500、1440和1600ng.mL−1标准曲线系列样品，以及血浆浓度分别为4.00ng.mL−1（定量下限）、10.0ng.mL−1、80.0ng.mL−1、1280ng.mL−1质控样品。3.L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灵敏的色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）对血浆样品进行前处理；/n（2）采用色谱-串联质谱法测定步骤（1）中经前处理后的血浆样品中乙胺丁醇的浓度；/n所述色谱-串联质谱法包括色谱条件和质谱条件，其中：/n所述色谱条件包括：采用Atlantis® dC18柱，梯度洗脱，在0min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在0.7min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在1min时，流动相A：流动相B体积比为15:85，在1.5min时，流动相A：流动相B体积比为15:85，在1.6min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在2.5min时，流动相A：流动相B体积比为65:35；流速0.7 mL/min，柱温40℃，进样量2 μL；/n所述质谱条件包括：离子源：电喷雾电离正离子检测；喷雾气温度：500℃；雾化气：65psi；气帘气：35 psi；碰撞气：9 psi；电离电流：3.0 uA；扫描时间：200 ms；扫描方式：多反应监测，用于定量的离子反应分别为：

【技术特征摘要】
1.一种灵敏的色谱-串联质谱法测定血浆中乙胺丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）对血浆样品进行前处理；
（2）采用色谱-串联质谱法测定步骤（1）中经前处理后的血浆样品中乙胺丁醇的浓度；
所述色谱-串联质谱法包括色谱条件和质谱条件，其中：
所述色谱条件包括：采用Atlantis®dC18柱，梯度洗脱，在0min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在0.7min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在1min时，流动相A：流动相B体积比为15:85，在1.5min时，流动相A：流动相B体积比为15:85，在1.6min时，流动相A：流动相B体积比为65:35，在2.5min时，流动相A：流动相B体积比为65:35；流速0.7mL/min，柱温40℃，进样量2μL；
所述质谱条件包括：离子源：电喷雾电离正离子检测；喷雾气温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄立峰，孙叶，顾琴，
申请(专利权)人：苏州必宜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32