一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法技术

本发明专利技术公开了青少年健康发育研究技术领域中的一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，首先，预先采集非AIS患者的不同时段的测试数据作为对照，其次，根据AIS患者的情况进行分组，收集分组的AIS患者临床实验资料，然后，将AIS患者不同时段的人骨髓间充质干细胞进行分离，并按照之前的分组进行体外培养，最后，对各分组体外培养的人骨髓间充质干细胞上提取MT1和MT2受体mRNA表达进行检测；通过本发明专利技术一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，为应用褪黑素受体激动剂及相关褪黑素通路调控因子治疗AIS患者提供新的临床预防治疗方案。

【技术实现步骤摘要】
一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法
本专利技术属于青少年健康发育研究
，具体涉及一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法。
技术介绍
青少年特发性脊柱侧凸（adolescentidiopathicscoliosis，AIS）是一种复杂的三维脊柱畸形，多发生于青春期女孩，其发病率大约为2％～4％，病因尚不清楚。AIS是青少年最常见的脊柱畸形之一,目前,AIS对患者相关的生活质量及心理健康的损害,以及这种损害对临床疗效的影响,是各国同行所关注的焦点之一。褪黑素(melatonin)是松果体分泌的一种神经内分泌激素，褪黑素及其受体与特发性脊柱侧凸之间的关系是AIS病因学研究中的一个热点。有研究发现，AIS患者成骨细胞中褪黑素信号转导通路存在异常，提示褪黑素信号通路异常可能是AIS发生的原因之一。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，可分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等，也是成骨细胞（osteoblast,OB）的祖细胞，MSCs的增殖能力降低和成骨分化能力下降、以及成脂分化能力增强均增加OP的发生。褪黑素通常是通过与其受体MT1、MT2结合后，引起一系列的细胞信号转导并最终产生生物学效应，因此在探讨AIS患者BMSCs褪黑素信号通路之前，必须对其褪黑素受体的表达进行研究。近年来干细胞研究的发展及进步，在各种不同组织先后发现了不同的干细胞，而且干细胞在不同疾病的治疗能力有各种各样的研究，其中当然也有AIS患者疾病发生过程中其骨髓间充质干细胞上MT1、MT2受体表达的情况的规律的研究。因此，干细胞的发展给了治疗AIS医学一道曙光。褪黑素受体是与Gi蛋白结合的一类受体,它与Gi蛋白结合后,可以抑制腺苷酸环化酶,导致细胞内cAMP的降低；血清褪黑素水平低下及褪黑素传导通路上Gi蛋白过度磷酸化的共同效应可能会引起褪黑素传导通路信号大小的改变,从而导致脊柱侧凸的产生；褪黑素对正常骨代谢的影响许多动物实验研究均发现体内褪黑素水平与骨密度呈正相关；褪黑素在影响骨代谢的过程中，无论在成骨和破骨细胞方面，都要重要的促进或者抑制的作用，褪黑素对骨的分化和生长是必不可少的影响因子之一,其作用可能主要是通过褪黑素Gi蛋白通路及相关的细胞核内受体直接作用所介导而起作用的；MSCs的增殖能力降低和成骨分化能力下降、以及成脂分化能力增强均增加OP的发生。AIS患者常伴有骨密度的改变以及体内褪黑素与其信号通路的改变，而且MSC在调控骨分化和生长过程中起着重要的作用，AIS患者是否会存在有MSC中有褪黑素受体的缺陷，从而影响其中的骨代谢的变化，他们之间是否会有时间上的依从性，这是我们值得探讨的方面，对于从生物分子水平临床预防治疗AIS的发生发展将会是一个重要的措施。而影响其中的骨代谢的变化，他们之间是否会有时间上的依从性，这是我们值得探讨的方面，对于从生物分子水平临床预防治疗AIS的发生发展将会是一个重要的措施。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有青少年健康发育研究
中存的缺陷，研究青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间充质干细胞中褪黑素受体表达与骨密度改变的时间相关性的情况，为进一步阐明AIS患者疾病发生过程中骨密度变化的发生规律，为临床治疗AIS骨密度的变化提供诊疗基础，为了解AIS的发病机制提供可靠的证据，提出一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法。为了实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，包括以下步骤：S1，预先采集非AIS患者的不同时段的测试数据作为对照；S2，根据AIS患者的情况进行分组，收集分组的AIS患者临床实验资料；S3，将AIS患者不同时段的人骨髓间充质干细胞进行分离，并按照之前的分组进行体外培养；S4，对各分组体外培养的人骨髓间充质干细胞上提取MT1和MT2受体mRNA表达进行检测。作为优选地，在S1中，所采集非AIS患者不同时段的测试数据采用抽样法，并采集多样化测试数据的平均值作为对照数据，以消除特殊数据带来的影响。作为优选地，在S2中，通过骨髓间充质干细胞体外培养体系为细胞检查提供筛选平台，用Percoll一步密度梯度离心法和传代筛选贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。作为优选地，在S2中，通过骨密度吸收仪测量患者腰椎骨密度、双侧近端股骨的骨密度。作为优选地，在S3中，根据褪黑素的昼夜特点分不同的时段抽取患者骨髓，采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。作为优选地，在S4中，将骨髓间充质干细胞体外培养并传至P3代，进行表型鉴定，抽提细胞的总RNA。作为优选地，在S4中，待细胞养至P3代90％融合时，用0.25％EDTA-胰蛋白酶消化，相差显微镜下计数板计数，取1×106个细胞FACSCalibur型流式细胞仪行表型鉴定，选用荧光标记小鼠抗人抗体CD90FITC、CD73PE、CD19PE、CD14FITC、CD34PE和HLA-DRFITC。作为优选地，在S4中，取5×106个P3代细胞，加1mlTRIzol试剂，吹打均匀，静置5min（室温），加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，静置3min，4℃12000r/min离心15min。取上层水相（约600ul）,加入异丙醇500ul，混匀，静置10min（室温），4℃12000r/min离心10min，见RNA沉淀，弃上清。75％酒精1ml震摇混匀，4℃7000r/min离心5min，弃上清，重复2次。风干酒精加入DEPC水充分溶解RNA沉淀。比色法测定样A260/280值，计算总RNA浓度。作为优选地，其特征在于，在含有0.5％溴化乙锭2％琼脂糖凝胶上加入扩增产物（MT1、MT2为7.5ul，β-actin为5.0ul）及1ul溴酚兰缓冲液，电压120V，电泳15min。使用紫外线电泳图像分析仪观察扩增条带，采用Smartview2001生物电泳图像分析系统对每个标本2次电泳条带灰度值进行半定量分析，取平均值。作为优选地，在S4中，采用RT-PCR方法检测褪黑素受体MT1、MT2mRNA的表达水平采用不同的时间段抽取AIS患者骨髓，采用RT-PCR方法检测受体mRNA表达情况,进一步明确提出褪黑素通路在AIS疾病的发生过程中的时间相关性，定期检测AIS患者骨密度改变的情况，采用统计软件进行分析比较骨密度的改变与患者褪黑素信号转导通路的关系。与现有技术相比，本专利技术的有益效果有：一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，通过医院实验中心建立的骨髓间充质干细胞体外培养体系，为研究提供细胞检查的筛选平台；利用骨密度吸收仪测量患者腰椎骨密度、双侧近端股骨的骨密度；根据褪黑素的昼夜特点分不同的时段抽取AIS患者骨髓，采用密度梯度离心法分离BMSCs，体外培养、纯化并传至P3代，进行表型鉴定；抽提BMSCs细胞的总RNA，采用RT-PCR方法检测褪黑素受体MT1、MT2mRNA的表达水平；采用不同的时间段抽取AIS患者骨髓，采用RT-PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，预先采集非AIS患者的不同时段的测试数据作为对照；/nS2，根据AIS患者的情况进行分组，收集分组的AIS患者临床实验资料；/nS3，将AIS患者不同时段的人骨髓间充质干细胞进行分离，并按照之前的分组进行体外培养；/nS4，对各分组体外培养的人骨髓间充质干细胞上提取MT1和MT2受体mRNA表达进行检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，预先采集非AIS患者的不同时段的测试数据作为对照；
S2，根据AIS患者的情况进行分组，收集分组的AIS患者临床实验资料；
S3，将AIS患者不同时段的人骨髓间充质干细胞进行分离，并按照之前的分组进行体外培养；
S4，对各分组体外培养的人骨髓间充质干细胞上提取MT1和MT2受体mRNA表达进行检测。


2.根据权利要求1所述的一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，在S1中，所采集非AIS患者不同时段的测试数据采用抽样法，并采集多样化测试数据的平均值作为对照数据。


3.根据权利要求2所述的一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，在S2中，通过骨髓间充质干细胞体外培养体系为细胞检查提供筛选平台，用Percoll一步密度梯度离心法和传代筛选贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。


4.根据权利要求3所述的一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，在S2中，通过骨密度吸收仪测量患者腰椎骨密度、双侧近端股骨的骨密度。


5.根据权利要求4所述的一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，在S3中，根据褪黑素的昼夜特点分不同的时段抽取患者骨髓，采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。


6.根据权利要求5所述的一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，在S4中，将骨髓间充质干细胞体外培养并传至P3代，进行表型鉴定，抽提细胞的总RNA。


7.根据权利要求6所述的一种褪黑素通路调控因子治疗AIS患者的测试方法，其特征在于，在S4中，待细胞养至P3代90％融合时，用0.25％EDTA-胰蛋白酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙欣，王朝军，魏波，彭智恒，傅青龙，
申请(专利权)人：孙欣，
类型：发明
国别省市：广东;44