一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法技术

本发明专利技术提供了一种分泌表达重组前动力蛋白2(PK2)的生产方法，属于生物医药技术领域。本方法通过设计筛选出合适的引物，两次扩增目的基因以获取外源基因，通过对获取的外源基因进行重建载体构建使其适于表达，并通过挑取单克隆诱导做小量表达、用保存菌种做大量表达、以及使蛋白亲和纯化制得具有活性的PK2目标蛋白。本发明专利技术具有能够快速获取具有活性的PK2，并且制备流程简单，所需费用较低等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法
本专利技术属于生物医药
，涉及一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法。
技术介绍
1999年，MollayC等在蛙的皮肤分泌物中分离出了一种分子量约为8KD的富含半胱氨酸残基的蛋白质，将其命名为Bv8。随后进一步的研究发现在哺乳类动物(如小鼠、大鼠、猴子以及人类)中也有Bv8同源蛋白的存在，分别将它们命名为Prokineticinl(PKl)和Prokineticin2(PK2或Bv8)。其中PK2主要与其受体PKRs相结合，促进胃肠平滑肌的收缩，调节细胞的增殖和存活。PKRs包括Prokineticinreceptor1(PKRl)和Prokineticinreceptor2(PKR2)，分别由位于染色体2ql4和20pl3区域上的PK0KR1和PK0KR2基因编码。PKRl和PKR2都属于G蛋白偶联受体，两者的结构上髙度相似，差别主要是C端的序列有一定的差异。PKRs与其配体结合后，能够通过与Gq蛋白相偶联升高细胞内钙离子浓度，影响细胞内信号转导，参与机体多种生理过程。最初研究发现PK2可促进胃肠平滑肌的收缩，后来进一步的研究发现PK2及PKRs在生殖系统、心血管系统以及中枢神经系统中都发挥病理生理效应。在生殖系统中，PK2可促进睾丸血管生成，主要是通过磷酸化EKR1/2和Akt抑制血管内皮细胞的凋亡。在心血管系统中，PK2在C57BL/6J小鼠心肌组织、H9c2细胞以及H5V细胞中都有表达，而在终期充血性心力衰竭患者心脏中PK2的表达显著下调；进一步的研究还发现PK2可通过PKRs激活EKR1/2和Akt信号通路促进血管生成，从而改善心脏功能和减轻心肌细胞损伤。PKR1基因敲除小鼠的体重明显增加，出现糖尿病症状；敲除前脂肪细胞中PKR1则增加其增殖和分化；而内皮特异性敲除PKR1的小鼠出现胰岛素抵抗，出现心脏和肾脏功能的紊乱。PKR2转基因小鼠心功能虽然没有发生改变，但却出现心肌的异常肥大；在H5V血管内皮细胞的研究中发现，PKR1基因下调可抑制PK2的促血管生成作用，而PKR2基因下调则对PK2的促血管生成作用没有明显影响。在中枢神经系统中，PK2可抑制NMDA所致的皮层神经元损伤，并可通过磷酸化EKR1/2和Akt减少低钾诱导的小脑颗粒细胞凋亡。在体外脑缺血模型中发现，PK2可减轻氧糖剥夺所致的脑片损伤，这种保护作用也与EKR1/2和Akt通路有关。在皮层神经元中发现，PK2能够增加AMPA受体介导的电流，并且通过PKC信号通路所介导。PK2的发现对于治疗心脑血管相关疾病具有重要的作用，但目前现有的PK2生产工艺复杂，并且价格昂贵，因此构建一套相对简单的P2K的生产工艺，并且具有活性且价格相对低廉PK2蛋白对其临床应用具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的技术存在的上述问题，提供一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法，本专利技术所要解决的技术问题是如何生产动力蛋白2。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法，其特征在于，本生产方法包括如下步骤：1.获取外源基因：1.1第一次扩增：使用无同源臂的引物进行凝胶电泳，根据片段大小配置1％-2％的琼脂糖凝胶，电泳电压120V，电泳20min-30min即可，使用302nm波长的激发光激发核酸染料，调整清晰度拍照记录并切胶回收；使用通用型胶回收试剂盒，切取DNAmarker指示的目的条带进行胶回收，最终洗脱时加入50ulEB溶液，无需测回收的cDNA片段浓度，直接用作第二次扩增的模板；1.2第二次扩增：再次PCR扩增目的基因，本次使用含同源臂的引物，具体步骤如第一次扩增，扩增完再次胶回收。2.重建载体构建：2.1酶切载体：使用选定的限制性内切酶，37℃酶切3小时以上，胶回收载体；2.2使用同源重组试剂盒进行无缝克隆；2.3冷却连接产物的同时，将感受态细菌从-80冰箱取出，置于冰上使其融化；2.4挑取单克隆摇菌提质粒测序；2.5选取正确质粒转化表达菌；感受态为DE3，参数同DH5a。3.蛋白表达纯化：3.1挑取单克隆摇菌、保菌后诱导做小量表达挑菌：用酒精灯灼烧冷却后的镊子夹取灭菌烘干的10ul移液器头，在平板上蘸取单克隆菌落，将移液器头丢进15ml离心管，加入5mlLBkana液态培养基，以火略管口和管盖，拧紧备用；摇菌：倾斜插入摇床，37℃，220rpm，摇菌至OD值＝0.6；诱导：留取500ul菌液至1.5ml无菌离心管，4℃暂存，在剩余的15ml离心管中加入4ul2000×IPTG，继续摇菌4-6小时；制样：转移15ml离心管至4℃离心机，水平转子，3900rpm，离心5-10min，弃干上层培养基；用量程200ul的移液器吸取200ulBuf.B重悬菌沉淀，转移菌液至1.5ml离心管中，加入50ul5×LoadingBuf.，混匀；将1.5ml离心管置入沸水中，加热10-15min，后转移至-20℃冰箱冷却5min，取出，放入离心机，12000rpm离心5min；上样时吸取上层清液10ul，加入1.5mm的蛋白胶，起初80V过浓缩胶，然后120V或以上继续电泳过分离胶；转膜及染色：在300mA下转印160min，然后用丽春红染色10min，水洗：采集：白光下观察、拍照。3.2用保存菌种做大量表达摇菌：将保存菌液加100ul到50ml无菌离心管中，再补充10ml-20mlLBkana液态培养基，过夜；扩菌：将过夜的菌液加入1LLBkana液态培养基中，37℃，220rpm，摇菌至OD值＝0.6；诱导：加入400ul2000×IPTG，继续摇菌4-6小时；收菌：使用离心瓶在4℃下，以3860rpm的离心转速离心40min，收集菌液；倒掉上层培养基，再加入5mlBuf.A，在振荡器上重悬菌液，然后吸至高速离心管，后配平。3.3蛋白亲和纯化破菌：根据菌沉淀量加入Buf.B20ml-30ml，然后加入相应体积的溶菌酶(100×)和PMSF(100×)，先用超声探头将沉淀冲击混匀，后置入冰水中，保证冰足够；超声完将超速离心管放置于4℃冰箱，30min后取出配平；更换角转子10000rpm，4℃，离心20min；用巴氏管吸出上清至新的50ml离心管中，置于冰上；制柱：充分刷洗层析柱，并用ddH2O润洗一遍，塞入塑料垫，固定于铁架台，加入1mlNi-NTAbeads，用10倍体积的Buf.B去平衡该柱子；加样：用吸管缓慢加入上清，避免飞溅，保证流速1.5s-1滴，直至全部流穿，用50ml离心管接取流穿液；洗杂：更换50ml离心管，缓慢加入Buf.C，保证流速，流穿3个柱子体积的Buf.C后，用“ModifiedBradfordreagent”检测残留蛋白含量，若洗杂不充分继续流穿Buf.C，直至变色不明显为止；超滤：更换水平转子，在4℃下，以3860rpm超滤至残留200本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法，其特征在于，本生产方法包括如下步骤：/n1.获取外源基因：/n1.1第一次扩增：使用无同源臂的引物进行凝胶电泳，根据片段大小配置1％-2％的琼脂糖凝胶，电泳电压120V，电泳20min-30min即可，使用302nm波长的激发光激发核酸染料，调整清晰度拍照记录并切胶回收；使用通用型胶回收试剂盒，切取DNA marker指示的目的条带进行胶回收，最终洗脱时加入50ulEB溶液，无需测回收的cDNA片段浓度，直接用作第二次扩增的模板；/n1.2第二次扩增：再次PCR扩增目的基因，本次使用含同源臂的引物，具体步骤如第一次扩增，扩增完再次胶回收。/n2.重建载体构建：/n2.1酶切载体：使用选定的限制性内切酶，37℃酶切3小时以上，胶回收载体；/n2.2使用同源重组试剂盒进行无缝克隆；/n2.3冷却连接产物的同时，将感受态细菌从-80冰箱取出，置于冰上使其融化；/n2.4挑取单克隆摇菌提质粒测序；/n2.5选取正确质粒转化表达菌；感受态为DE3，参数同DH5a。/n3.蛋白表达纯化：/n3.1挑取单克隆摇菌、保菌后诱导做小量表达/n挑菌：用酒精灯灼烧冷却后的镊子夹取灭菌烘干的10ul移液器头，在平板上蘸取单克隆菌落，将移液器头丢进15ml离心管，加入5ml LB...

【技术特征摘要】
1.一种分泌表达重组前动力蛋白2的生产方法，其特征在于，本生产方法包括如下步骤：
1.获取外源基因：
1.1第一次扩增：使用无同源臂的引物进行凝胶电泳，根据片段大小配置1％-2％的琼脂糖凝胶，电泳电压120V，电泳20min-30min即可，使用302nm波长的激发光激发核酸染料，调整清晰度拍照记录并切胶回收；使用通用型胶回收试剂盒，切取DNAmarker指示的目的条带进行胶回收，最终洗脱时加入50ulEB溶液，无需测回收的cDNA片段浓度，直接用作第二次扩增的模板；
1.2第二次扩增：再次PCR扩增目的基因，本次使用含同源臂的引物，具体步骤如第一次扩增，扩增完再次胶回收。
2.重建载体构建：
2.1酶切载体：使用选定的限制性内切酶，37℃酶切3小时以上，胶回收载体；
2.2使用同源重组试剂盒进行无缝克隆；
2.3冷却连接产物的同时，将感受态细菌从-80冰箱取出，置于冰上使其融化；
2.4挑取单克隆摇菌提质粒测序；
2.5选取正确质粒转化表达菌；感受态为DE3，参数同DH5a。
3.蛋白表达纯化：
3.1挑取单克隆摇菌、保菌后诱导做小量表达
挑菌：用酒精灯灼烧冷却后的镊子夹取灭菌烘干的10ul移液器头，在平板上蘸取单克隆菌落，将移液器头丢进15ml离心管，加入5mlLBkana液态培养基，以火略管口和管盖，拧紧备用；
摇菌：倾斜插入摇床，37℃，220rpm，摇菌至OD值＝0.6；
诱导：留取500ul菌液至1.5ml无菌离心管，4℃暂存，在剩余的15ml离心管中加入4ul2000×IPTG，继续摇菌4-6小时；
制样：转移15ml离心管至4℃离心机，水平转子，3900rpm，离心5-10min，弃干上层培养基；用量程200ul的移液器吸取200ulBuf.B重悬菌沉淀，转移菌液至1.5ml离心管中，加入50ul5×LoadingBuf.，混匀；将1.5ml离心管置入沸水中，加热10-15min，后转移至-20℃冰箱冷却5min，取出，放入离心机，12000rpm离心5min；上样时吸取上层清液10ul，加入1.5mm的蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡飞，李彩蓉，吴攀峰，张如意，
申请(专利权)人：湖北科技学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42