泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法技术

本发明专利技术涉及生物分离技术领域，具体涉及一种用于泰乐菌素适配体和替米考星适配体筛选的毛细管电泳方法。对泰乐菌素和替米考星与随机单链寡核苷酸文库混合孵育后的溶液分别进行毛细管电泳分离，利用单链寡核苷酸分别与泰乐菌素和替米考星结合所形成的两种复合物与游离单链寡核苷酸之间的淌度差异可使两种复合物分别与游离单链寡核苷酸分离。在电泳开始后的0‑5min之间可以分别有效收集与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸。将其分别作为次级文库再次筛选，经过仅2轮筛选即可分别得到对泰乐菌素和替米考星具有高亲和力的两种适配体。

【技术实现步骤摘要】
泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法
本专利技术涉及生物分离
，具体涉及一种用于泰乐菌素适配体和替米考星适配体筛选的毛细管电泳方法。
技术介绍
适配体是单链短脱氧核糖核酸(ssDNA)序列或核糖核酸(RNA)序列，碱基互补配对形成的高级结构能够使其高特异性识别并高亲和性结合特定的靶物质，这种特性使适配体在食品安全检测领域展现了广阔的应用前景。适配体属于寡核苷酸，碱基组成顺序的随机性使得这类物质数量极其庞大，对于长度为20-220nt的寡核苷酸序列来说，其数量可高达1015个。从如此众多的随机组成序列中将一个或数个对某特定靶标具有高特异性和高亲和性的序列选出是一件十分费时的工作。传统的适配体筛选方法是指数富集配体系统进化(SELEX)方法，包括使用磁珠、琼脂糖、微孔板等固体载体的方法。这类方法通常将靶标固定在固体载体上，令由大量随机序列构成的初始文库与其孵育一定时间，将结合到载体上的序列洗脱后进行PCR扩增和纯化，得到次级文库；重复这些步骤，直到获得适配体。一般需要经过十几轮的反复筛选才能得到对靶标亲和性足够高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于，对泰乐菌素和替米考星与随机单链寡核苷酸文库混合孵育后的溶液分别进行毛细管电泳分离，利用单链寡核苷酸分别与泰乐菌素和替米考星结合所形成的两种复合物与游离单链寡核苷酸之间的淌度差异可使两种复合物分别与游离单链寡核苷酸分离；在电泳开始后的0-5min之间能够分别有效收集与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸，将与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸分别作为次级文库再次采用同样方法筛选；分别对第2轮筛选后获得的两种收集溶液进行对称PCR，并对PCR扩增产物分别进行凝胶电泳纯化，纯化后产物分别进行高通量测序；从各自的测序结果中将出现频率...

【技术特征摘要】
1.泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于，对泰乐菌素和替米考星与随机单链寡核苷酸文库混合孵育后的溶液分别进行毛细管电泳分离，利用单链寡核苷酸分别与泰乐菌素和替米考星结合所形成的两种复合物与游离单链寡核苷酸之间的淌度差异可使两种复合物分别与游离单链寡核苷酸分离；在电泳开始后的0-5min之间能够分别有效收集与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸，将与泰乐菌素和替米考星结合的单链寡核苷酸分别作为次级文库再次采用同样方法筛选；分别对第2轮筛选后获得的两种收集溶液进行对称PCR，并对PCR扩增产物分别进行凝胶电泳纯化，纯化后产物分别进行高通量测序；从各自的测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列分别选出作为适配体候选物进行合成，同时合成其各自的互补序列；分别对合成的各适配体候选物测定解离常数，从中各自选出解离常数最小的适配体候选物，即为最后确定的泰乐菌素适配体和替米考星适配体。


2.如权利要求1所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将45μL浓度100μmol/L经变性处理后的随机ssDNA文库与5μL浓度10g/L的泰乐菌素室温混合孵育30min，或与5μL浓度10g/L的替米考星室温混合孵育30min，形成由泰乐菌素-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离泰乐菌素组成的混合物溶液，或形成由替米考星-ssDNA复合物、游离ssDNA和游离替米考星组成的混合物溶液；
(2)将两种混合物溶液分别注入毛细管柱进行分离，均收集电泳开始后0-5min之间从毛细管中流出的溶液；此过程各重复10次，各自合并10次过程收集的电泳流出溶液分别作为次级文库，至此两种适配体筛选的第1轮结束；
(3)各取45μL变性处理后的两种次级文库分别对应与5μL浓度10g/L的泰乐菌素和替米考星室温混合孵育30min，重复步骤(2)，完成第2轮筛选；
(4)分别对第2轮筛选后获得的两种收集溶液进行对称PCR，并对PCR扩增产物分别进行凝胶电泳纯化，纯化后产物分别进行高通量测序；
(5)从各自的测序结果中将出现频率由高至低排列在前7位的序列分别选出作为适配体候选物进行合成，同时合成其各自的互补序列；
(6)分别对合成的各适配体候选物测定解离常数，从中各自选出解离常数最小的适配体候选物，即为最后确定的泰乐菌素适配体和替米考星适配体。


3.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述随机ssDNA文库是指由两端各22个核苷酸构成的固定引物序列和中间40个核苷酸构成的随机序列组成的寡核苷酸库，即5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-N40-CTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3'。


4.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(1)和步骤(3)中，变性处理是指先将文库95℃加热10min，再立即冰浴10min。


5.如权利要求2所述的泰乐菌素适配体和替米考星适配体的毛细管电泳筛选方法，步骤(2)中，所述分离按如下电泳条件进行：熔融石英毛细管，长度60cm，有效长度50cm，内径100μm；运行缓冲液为80mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：高志飞，陈冠华，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32