三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用，包括下列步骤：（1）取叶片提取基因组DNA；（2）按照简化基因组测序技术Super‑GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；（3）对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点，并对SNP进行过滤，以提高SNP的准确性；（4）根据每个品种的分型结果筛选不同品种间至少有一个品种与其他品种不同的位点；（5）根据上述筛选策略，最终筛选到11个鉴定3种嘎啦苹果的SNP位点。基于这些标记开发出一种简便、快速、可靠鉴定三种嘎啦苹果的方法，为从源头准确控制品种奠定技术基础；三种嘎啦苹果的组培苗、嫁接苗能够准确的区分，确保育种企业对品种的把控，减少由于品种误差造成的经济损失。

【技术实现步骤摘要】
三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用
本专利技术涉及三种嘎啦苹果特异性分子标记及其筛选方法和应用，属于生物

技术介绍
苹果(MaluspumilaMill.)是世界上重要的落叶果树之一，深受消费者喜欢，近年来发展十分迅速。我国已成为世界上最大的苹果生产国和出口国，我国苹果栽培面积和产量分别为246.69万hm2和4388.23万t，均居世界首位(丛佩华等,2018)。全世界有将近上万个登记的苹果品种，目前我国主栽的苹果主要有8个系列，60余个品种，其中最重要的6个系列分别是富士系(63.5％)、元帅系(7.6％)、秦冠(14.6％)、嘎拉(1.9％)、华冠(3.7％)、金冠(1.4％)、栽植面积之和占全国栽植总量的92.4％。在过去的几十年中，通常根据形态、生理和一些农艺性状对果树品种(系)进行鉴定。然而，传统的基于形态性状的品种鉴定需要广泛的观察成熟的植物。而且，在许多情况下，它缺乏准确的定义和客观性(Wrigleyetal.,1987)。此外，受环境影响，形态学性状不能作为明确的标记。嘎啦系列苹果中嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦是目前嘎啦系列品种的主栽品种，但这三种苹果在苗期相似度非常高，而我国目前苹果品种正处在新旧品种更替，矮化密植已经是发展的趋势，因此提供简便可靠的方法确保种苗企业能够从源头上对品种控制准确显得尤为重要。DNA分子标记技术也称为DNA指纹图谱技术，能以个体间遗传物质的核苷酸序列变异为基础，直接反应不同品种/亚群间基因组水平上的遗传多态性，具有可遗传性和可识别性。在过去的20年间，分子标记技术的快速发展成功的解决了这一难题。另一方面，不像限于多态性和时空变化的生化标记，品种特异的遗传标记因不受生理或环境的影响而在品种鉴定工作中呈现独特的优势。
技术实现思路
针对现有技术中三种嘎啦苹果苗期不易鉴定的缺陷，本专利技术提供一种嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦苹果的特异性分子标记的筛选方法，并应用该方法鉴定到11个品种特异的SNP标记，基于这些标记开发出一种简便、快速、可靠鉴定三种嘎啦苹果的方法，为从源头准确控制品种奠定技术基础。为解决上述技术问题，本专利技术采用下述技术方案予以实现：首先，本专利技术提供一种利用简化基因组测序技术Super-GBS筛选嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦苹果的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：(1)利用品种已知的12个嘎啦、9个nema嘎啦和5个新嘎啦苹果为样品，取叶片提取基因组DNA；(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；(4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点。(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到11个SNP位点，具体见下表1。表1能够准确区分三种嘎啦苹果的位点信息染色体CHROM位置POS嘎啦新嘎啦nema嘎啦Chr1232563027TTGTGTChr1232563033TTGTGTChr1232563350TTCTCTChr1232563358GGGTGTChr157682410AAAAAGChr157682428TTTTCTChr157682449TTTTCTChr157682485TTTTCTChr811158568AAAAAGChr811158602CCCCCTChr811158937TTTTCT本专利技术的有益效果：三种嘎啦苹果的组培苗、嫁接苗能够准确的区分，确保育种企业对品种的把控，减少由于同系列品种误差造成的经济损失。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1附图为利用筛选到的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦特异标记构建进化树。利用筛选到的11个特异性SNP能够明确的区分三种嘎啦苹果。图2附图为利用筛选到的嘎啦系列的11个SNP位点对嘎啦系列苹果的品种进行分类。具体实施方式实施例1本实施例提供一种利用简化基因组测序技术Super-GBS筛选嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦苹果的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：(1)利用品种已知的12个嘎啦、9个nema嘎啦和5个新嘎啦苹果为样品，取叶片提取基因组DNA；(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点；(4)对SNP进行过滤，过滤条件为：SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点。(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到11个SNP位点。具体的操作步骤如下：本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。1.酶切：对本公司购买的标准机构提供的品种准确的嘎啦、nema嘎啦和新嘎啦分别12株、9株、5株进行Super-GBS建库，具体过程如下(以下为每个样品酶切试剂使用量)：所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。2.连接：在40μL体系中连接adapter，barcode及酶切片段。所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。3.纯化取连接产物35μL加入0.7倍体积的Sera-Magbeads(GEHealthcareLifeSciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μL70％酒精洗脱3遍。最后用40μl10mMTris.HCl(pH8.0)从磁珠中回收DNA。4.扩增所有成分混匀后置于PCR仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦苹果特异分子标记的文库构建接头及引物序列：/n

【技术特征摘要】
1.利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦苹果特异分子标记的文库构建接头及引物序列：








名称
序列(5’-3’)


Commonadaptortop
GATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT


Commonadaptorbot
CGAGATCGGAAGAGCGGGGACTTTAAGC


PstIadaptortop
CACGACGCTCTTCCGATCTAACXXXXXXTGCA


PstIadaptorbot
YYYYYYAGATCGGAAGAGCGTCGTG


Primer1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT


Primer2
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAA








2.利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦苹果特异分子标记的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)利用品种确认的12个嘎啦、9个nema嘎啦和5个新嘎啦苹果为样品，取叶片提取基因组DNA；
(2)按照简化基因组测序技术Super-GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
(3)对测序数据进行过滤后，使用GATK获得SNP位点，并对SNP进行过滤，以提高SNP的准确性；
(4)根据每个品种的分型结果，首先剔除所有样品中分型一致的位点，然后筛选每个品种内所有个体分型完全一致、且没有个体缺失的位点，最后筛选不同品种间至少有一个品种与其他品种不同的位点；
(5)根据上述筛选策略，最终筛选到11个鉴定3种嘎啦苹果的SNP位点。


3.根据权利要求2所述的利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦特异分子标记的方法，其特征在于，SNP过滤条件为SNP测序深度不低于4；剔除MAF小于0.01的位点；剔除SNP分型缺失率高于20％的位点。


4.根据权利要求2所述的利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦特异分子标记的方法，其特征在于，所述步骤(4)是筛选特异分子标记的策略，必须保证每个品种的每个样品都有分型信息。


5.根据权利要求2所述的利用简化基因组技术Super-GBS筛选嘎啦特异分子标记的方法，其特征在于，筛选到11个嘎啦苹果特异的分子标记，其信息如下所示：











染色体CHROM
位置POS
嘎啦
新嘎啦
nema嘎啦


Chr12
32563027
TT
GT
GT


Chr12...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼秀媚，钟飞，王晓菲，王彦娟，王超，吕金浮，刘晓明，刘永光，
申请(专利权)人：山东丰沃植物研究院有限公司，潍坊科技学院，青岛欧易生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37