一种与辣椒果实角质层缺乏基因连锁的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与辣椒果实角质层合成基因连锁的分子标记及应用。利用野生型与突变型辣椒材料构建了F

【技术实现步骤摘要】
一种与辣椒果实角质层缺乏基因连锁的分子标记及应用
本专利技术属于辣椒育种分子生物学领域，涉及辣椒(CapsicumannuumL)果实角质层合成基因连锁的分子标记及该分子标记在辣椒果实角质层鉴定和育种中的应用。
技术介绍
大约在4.5亿年前的中古时代，植物开始殖民到干旱的栖息地，此时陆地植物面临的最大挑战是干燥，所以允许植物在陆地定植的最关键的进化创新就是以疏水性皮肤或角质层的形式开发专门的表皮细胞壁，以限制蒸腾水分流失。因此，几乎所有陆地植物地上器官的外表面都存在角质层。除了防止水分散失外，作为植物一级保护屏障的角质层同样也发挥其他重要的生理作用，如抵抗生物胁迫如病虫害，防护非生物胁迫如渗透胁迫和辐射等。植物角质层的结构复杂并含多种组分，通常情况下，其主要由两种脂质成分组成：一种主要是脂肪族的有机溶剂溶性化合物，称为蜡；另一种是结构复杂的酯化含氧脂肪酸聚合物，称为角质。这些成分一起形成了一个抵御环境压力的弹性屏障，如干燥、害虫和病原体。目前对于角质层相关基因的研究报道还是相对较少，大部分集中在拟南芥和番茄两种模式植物。拟南芥中角质层蜡质突变体最多的是cer突变体。cer1、cer2和cer6突变体为光泽型，cer1突变体和cer6突变体的的基因多效性结果均是降低育性，但一个基因功能是与蜡质成分的运输(或分泌)有关，另一个则是编码脂肪酸代谢酶；cer2变体的的基因多效性结果是阻断C28的延长，与拟南芥生长调控有关；cer3和cer10突变体呈现微白粉状蜡质，其基因多效性结果分别为阻断碳链延长和花器官融合从而降低育性；cer13突变体呈现半白粉状蜡质，同样是导致花器官融合，降低育性。而在番茄中，SlSHN3基因属于AP2(APETALA2)家族，并在绿熟期的番茄果实外表皮中有效表达，SlSHN3沉默表达会降低番茄角质层中蜡质和角质的含量；HD-ZipIV家族成员CD2角质突变基因在番茄果实角质的生物合成中发挥着关键的调控作用；FUL1/2和TAGL1基因都属于MADS-box家族，FUL1/2沉默表达后会导致番茄果实脂质和角质层的代谢发生改变，TAGL1基因的超量表达会增加角质层的数量及其组分。辣椒(CapsicumAnnuumL.)属于茄科辣椒属，为一年或有限的多年生草本植物，作为世界范围的主要蔬菜作物及人们喜爱的蔬菜之一，辣椒在整个蔬菜生产中占有重要地位，在茄科中排名第四，仅次于番茄、马铃薯和茄子，特别是在我国，因其超高的种植效益，辣椒成为了农民发家致富的主要作物，因此辣椒的种植面积仍然在不断扩大。目前辣椒在果实发育、新品种选育、抗病抗虫研究、设施栽培、辣椒红素、辣椒素及提取物抗氧化方面的研究较多，但在果实角质层方面的研究尚缺，因此辣椒果实角质层缺乏突变体作为一种重要的种质资源，将会深受未来育种家们的青睐。通过开发与辣椒果实角质层合成基因连锁的分子标记，采用杂交和回交等技术快速的将角质层合成基因与其他优良性状基因导入到植株中，为选育高质量的新品种提供基因资源。开发与角质层合成基因连锁的分子标记，有利于果实角质层最适厚度辣椒的选育，且为克隆辣椒果实角质层合成基因，研究角质层合成的分子机制奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于针对辣椒果实表面中出现的角质层缺乏现象，提供一种与辣椒果实角质层合成基因连锁的分子标记Paper_200104484。为果实角质层缺乏型辣椒突变体的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒果实角质层缺乏性状，以及果实角质层缺乏型辣椒的育种等提供新的途径。一种与辣椒果实角质层合成基因连锁的分子标记，具体在辣椒全基因组12号染色体的200104484bp处G向A的突变。所述的分子标记对应的基因型：G:G为具有果实角质层的基因型、A:G为具有果实角质层的基因型、A:A为不具有果实角质层的基因型。针对辣椒果实角质层合成突变设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，正向引物X：CTTAGAAGGAGAGGCTGACAAGTG，见SEQIDNo.1所示；正向引物Y：CTTAGAAGGAGAGGCTGACAAGTA，见SEQIDNo.2所示。两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列(LGC公司的FAM或HEX接头序列)优选：FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，见SEQIDNo.3所示；HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，见SEQIDNo.4所示。分别连接不同的荧光接头序列后的引物序列如下：Paper_200104484F-1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTAGAAGGAGAGGCTGACAAGTG，见SEQIDNo.5所示；Paper_200104484F-2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTAGAAGGAGAGGCTGACAAGTA，见SEQIDNo.6所示；Paper_200104484C(反向引物)：CGCTGACGAGAACTAGACATCTG，见SEQIDNo.7所示。本专利技术的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于辣椒果实角质层的选育，且为克隆角质层合成基因，研究果实角质层缺乏型辣椒的分子机制奠定基础。具体如下：1.分子标记用于鉴定和辅助筛选果实角质层缺乏型辣椒。2.分子标记用于果实角质层缺乏型辣椒育种。3.分子标记应用时，采用PCR反应进行检测。分子标记应用时，具体包括以下步骤：(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；(2)对扩增产物进行检测与分析。对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到引物Paper_200104484F-1对应的荧光信号，则检测位点为G:G基因型，判定为辣椒果实具有角质层表型的单株；如果样品PCR产物只检测到引物Paper_200104484F-2对应的荧光信号，则检测位点为A:A基因型，判定为辣椒果实角质层缺乏表型的单株；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为A:G基因型，判定为辣椒果实具有角质层表型的单株。分子标记应用时，采用TouchdownPCR，扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。本专利技术利用BSA定位的方法，定位到一个控制辣椒果实角质层合成的基因，并依据该基因的突变位点，开发了与该辣椒果实角质层合成基因相关联的KASP分子标记。可以直接用于辣椒果实角质层和相对应的基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。可以用于各种品种的辣椒鉴定，因此，本专利技术在研究辣椒果实角质层的形成机制和理论研究上具有重大的意义。附图说明图1为BSA群体定位的2个亲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与辣椒果实角质层合成基因连锁的分子标记，其特征在于，为辣椒基因组12号染色体上200104484bp位置处发生的G向A的突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种与辣椒果实角质层合成基因连锁的分子标记，其特征在于，为辣椒基因组12号染色体上200104484bp位置处发生的G向A的突变。


2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记对应的基因型：G:G为具有果实角质层的基因型、A:G为具有果实角质层的基因型、A:A为不具有果实角质层的基因型。


3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，针对辣椒果实角质层合成突变设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，
正向引物X：CTTAGAAGGAGAGGCTGACAAGTG
正向引物Y：CTTAGAAGGAGAGGCTGACAAGTA。


4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于：两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列；
优选：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。


5.权利要求1-4任一项所述的分子标记的应用，其特征在于：用于鉴定和辅助筛选果实角质层缺乏型辣椒。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘峰，谢玲玲，易婷，郑井元，周书栋，马艳青，戴雄泽，邹学校，
申请(专利权)人：湖南省蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43